肠源性TPH1、LRP5表达及血清5-HT水平与雄性大鼠增龄性骨量丢失相关

胡庭毅，张 健，陈 潇，蔡 枭，熊 科

(重庆医科大学第一附属医院 骨外科， 重庆 404100)



研究论文

肠源性TPH1、LRP5表达及血清5-HT水平与雄性大鼠增龄性骨量丢失相关

胡庭毅，张 健*，陈 潇，蔡 枭，熊 科

(重庆医科大学第一附属医院 骨外科， 重庆 404100)

目的观察不同月龄SD雄性大鼠十二指肠TPH1、LRP5表达水平及血清5-HT水平，分析其在增龄中的变化及增龄性骨量丢失的相关性。方法分别选取2、6、12、15和18月龄大鼠各6只，共30只，按照月龄分组以模拟增龄性模型。分别用RT-PCR法、Western blot法检测十二指肠TPH1和LRP5的mRNA和蛋白表达，用 ELISA方法检测血清5-HT水平，双能骨密度仪测定大鼠离体股骨骨密度。结果十二指肠TPH1 mRNA和蛋白表达及血清5-HT水平随年龄的增长而增加，与增龄性骨量丢失呈负相关性(P<0.001)。结论肠源性5-HT及其关键合成限速酶TPH1表达在增龄性骨量丢失中发挥着重要作用，可能成为老年性骨质疏松潜在治疗干预靶。

LRP5；TPH1；5-HT；老年性骨质疏松

骨组织结构、强度及功能是通过骨吸收和骨形成之间的动态耦联平衡相维系的。随着年龄的增长，这种微妙平衡逐渐被打破，呈现以骨形成绝对不足为特征的低转换病理状态。其过程中骨量逐渐丢失，骨皮质变薄及骨小梁紊乱等微结构破坏，最终导致骨脆性增加及病理性骨折。WHO将这种生理病理退行性病变定义为老年性骨质疏松症。衰老作为独立的危险因素在其发生发展中起着至关重要的作用，且还间接介导了多种机制影响[1]。近年的研究发现肠源性5-HT水平通过内分泌途径对骨代谢产生着重要负性调控作用[2]。经典的骨量调节蛋白LRP5可能通过调节肠道tryptophan hydroxylase 1(TPH1)表达而对骨代谢产生影响[3]。本实验通过研究LRP5/TPH1/5-HT通路与增龄骨量丢失关系，旨在为增龄相关骨量丢失寻找潜在的治疗干预靶。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

SPF级雄性SD大鼠30只(爱尔麦特科技有限公司，实验动物许可证号：SCXK苏2009- 0001)。按照月龄分为2、6、12、15和18月组,每组各6只,分别标号为A、B、C、D和E组，以复制自然衰老大鼠不同年龄阶段生理状况。处理标本期间自由摄水，标准饲料自由摄食。温度(22±2)℃、人工照明昼夜交替12 h∶12 h、相对湿度55%。

1.2 样本采集处理

术前腹腔注射10%水合氯醛(10 mL/kg)麻醉后，取动脉血分离血清，-20 ℃冻存。取右侧股骨予剥离附着软组织，0.9%氯化钠注射液洗净，放入标本袋中待测。开腹剪取十二指肠标本 (距幽门部2 cm),0.9%氯化钠溶液洗净，将截取组织用液氮冰冻后，-80 ℃冻存。

1.3 主要试剂

Rabbit-anti-rat TPH1抗体BA1449、Rabbit-anti-rat LRP5抗体BA4305- 2和mouse-anti-rat β-actin抗体BA2305(武汉博士德生物工程公司)；动物组织总RNA提取试剂盒、TIAN script反录试剂盒和PCR扩增试剂盒FP205(天根生化科技有限公司)；5-HT ELISA试剂盒(上海凯博生化试剂有限公司)；PCR引物(上海生工生物有限公司设计合成)。

1.4 数据检测

1.4.1 股骨骨密度：应用双能X线骨密度仪(Hologic公司, DEXA,QDR4500Fanbeam)及所附Small animal软件对整段股骨纵向扫描。

1.4.2 RT-PCR法测定LRP5、TPH1 mRNA表达：参照提取试剂盒(DP431)说明书提取总RNA，据TIAN script反转录试剂盒说明书合成cDNA模板，加入上下游引物进行扩增。TPH1上游5′-CCTGCAAACA GGAATGTCT- 3′，下游5′-TCTGGACTGATGCTCAAA GG-3′，片段300 bp；LRP5上游5′-GACCTGATGGG ACTCAAAGC-3′，下游5′-TCCAGTAGATGTGGTTGT TGG-3′，片段316 bp；内参GAPDH上游5′-TATCGG ACGCCTGGTTAC-3′，下游5′-GGAAGATGGTGATG GGTTT-3′，片段194 bp。凝胶电泳后，成像扫描进行半定量分析。

1.4.3 Western blot法测定蛋白表达：将组织剪碎，混入总蛋白提取试剂冷浴匀浆，经过裂解后离心，待变性5min后取上清液，-80 ℃保存备用。取标本上样后，行SDS-PAGE电泳后，利用湿转移电泳法将蛋白转移至PVDF膜。室温下将膜浸入5%脱脂牛奶中，摇动封闭2 h，再分别与一抗兔抗TPH1(1∶200)、鼠抗β-actin(1∶1 000)4 ℃孵育过夜。将膜分别与小鼠及兔来源的二抗(分别是1∶1 000和1∶500)孵育2 h，洗膜6次。ECL显色后照相。图像分析，测TPH1或LRP5或和β-actin的吸光度比值。

1.4.4 ELISA法检测血清5-HT水平：按大鼠5羟色胺(5-HT)Elisa试剂盒操作要求检测血清5-HT水平。取出酶标板，依次对应分别加入100 μL的标准品于空白微孔中；分别标记样品编号，加入100 μL样品与空白微孔中；在标准品孔和样品孔中加入50 μL的酶标记溶液；(36±2)℃孵育反应60 min；洗板5次，每次静置10～20 min；每孔加入底物A、B液各50 μL； (36±2)℃下避光孵育反应15 min；每孔加入50 μL终止液，终止反应；于波长450 nm的酶标仪上读取个孔的A值；绘制标准曲线以读取数据。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 不同月龄组大鼠股骨骨密度变化

12、15、18月龄组骨密度均数较6月龄组明显降低 (P<0.01)(表1)。

2.2 不同月龄组血清5-HT水平变化

各月龄组血清5-HT均值随着年龄增长逐渐增高，12、15和18月龄组大鼠血清5-HT均值较6月龄组水平显著升高 (P<0.01)(表1)。

表1 不同月龄组大鼠骨密度及血清5-HT值

*P<0.05，**P<0.01 compared with group A.

2.3 不同月龄组大鼠十二指肠组织TPH1 mRNA表达情况

12、15和18月龄组较6月龄组TPH1 mRNA表达均显著上调(P<0.01)， 12月龄组较6月龄组表达上调约1.6倍(P<0.01)，18月龄组较6月龄组表达上调约2.5倍(图1，表2)。

图1 不同月龄组大鼠TPH1 mRNA表达变化Fig 1 The expression change of the TPH1 mRNA in rats of different months

2.4 不同月龄组大鼠十二指肠组织TPH1蛋白表达情况

12、15和18月龄组较6月龄组TPH1蛋白表达均显著上调(P<0.01)，18月龄组较6月龄组表达上调近3倍(图2，表2)。

图2 不同月龄组大鼠TPH1蛋白水平变化Fig 2 The expression change of the TPH1 protein level in rats of different months

2.5 不同月龄阶段十二指肠组织LRP5 mRNA表达情况

各月龄组LRP5 mRNA表达无明显年龄变化趋势(图3，表2)。

2.6 不同月龄阶段十二指肠组织LRP5蛋白表达情况

各月龄组LRP5蛋白表达无明显年龄变化趋势(图4，表2)。

图3 不同月龄组大鼠LRP5 mRNA表达变化Fig 3 The expression change of the LRP5 mRNA in rats of different months

groupTPH1mRNATPH1protein LRP5mRNALRP5proteinA0067±0013133±006054±013041±007B0076±0012118±012∗050±010037±001C0126±0014∗∗221±013∗∗046±006039±005D0174±0013∗∗287±015∗∗055±008044±006E0192±0010∗∗332±021∗∗058±007047±005

*P<0.05，**P<0.01 compared with group A.

图4 不同月龄组大鼠LRP5蛋白表达变化Fig 4 The expression change of the LPR5 protein level in rats of different months

2.7 TPH1、LRP5表达水平及血清5-HT水平与增龄相关的骨量丢失的相关性

骨密度与十二指肠TPH1 mRNA呈显著负相关(P<0.001)；与TPH1蛋白表达呈显著负相关(P<0.001)；与血清5-HT水平呈负相关(P<0.001)。

3 讨论

外周和中枢5-HT分属于独立的功能系统对骨代谢产生调节作用[4]。TPH1是外周5-HT合成链中关键限速酶，外周中约95% 5-HT由TPH1特异表达的胃肠嗜铬细胞产生，并以十二指肠表达特异性最高[5]。约不足5% 5-HT以游离形态存在于血清中，通过循环作用于远端骨组织靶细胞受体[5- 6]。特异性抑制肠道TPH1表达或降低外周血清素水平可明显改善骨量[2,7]。

作为新骨代谢研究热点，外周5-HT对骨代谢功能机制已得到了部分诠释。成骨细胞、破骨细胞表面存在着众多5-HT受体亚型[6]，5-HT正是激活不同的受体亚型通路发挥生理作用。特异性敲除5-HTR1B的效果和阻断5-HT的合成一样会使动物骨量增加，通过作用5-HT1B受体,经蛋白激酶A-环磷酸腺苷(PKA-cAMP)途径抑制cAMP产生和转录因子(CREB)的磷酸化, 下调周期蛋白基因的表达，从而降低成骨细胞的增殖[3]。另外5-HT2A受体可能通过PLC-PKC信号途径对骨代谢产生影响[8]。而5-HT2B的功能作用并未完全阐明，可能通过多种途径对骨代谢产生影响[6]。

以往研究对其作用机制和去势动物的干预进行一定探讨，但5-HT是否在增龄性骨量丢失中发挥作用并未见相关报道。本实验通过对不同年龄雄性大鼠研究发现，衰老大鼠血清5-HT水平和肠道中TPH1 mRNA、蛋白表达随年龄逐渐增高，处于老年阶段的18月龄大鼠较成年阶段6月龄大鼠血清5-HT水平和TPH1表达显著增高。且通过相关分析显示，血清5-HT和TPH1 mRNA及蛋白表达与增龄相关骨量丢失呈现显著负性相关性。

值得关注的是，LRP5作为人体主要的骨量调节蛋白，除通过经典的Wnt信号通路外，可能还通过特异性抑制肠嗜铬细胞TPH1表达,从而调控成骨细胞增殖[3]。据此对LRP5研究亦发现，其在增龄过程中表达趋于稳定，无明显年龄相关性。

综上所述，TPH1/5-HT通路表达与增龄性骨量丢失呈现明显负相关性。其关键因子均可能成为增龄性低骨量疾病的潜在治疗干预靶。开发TPH1抑制剂、相关单抗生物制剂及针对5-HT功能受体制剂等药物，可能对老年性骨质疏松症的预防与治疗有着重要意义。但是外周5-HT来源广泛，虽然肠道来源的5-HT发挥了重要作用[2，6]，但自分泌、旁分泌及神经途径来源的5-HT是否也存在作用，且5-HT在人类增龄性骨量丢失中是否也存在相关等问题仍有待进一步研究。

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Relationships between enterogenous TPH1, expression of LRP5, serum level of 5-HT and aging bone mass loss of the male rats

HU Ting-yi, ZHANG Jian*, CHEN Xiao, CAI Xiao, XIONG Ke

(Dept. of Orthopedic Surgery, the First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University,Chongqing 404100, China)

Objective To observe the expression levels of duodenal TPH1 and LRP5 as well as the level of serum 5-HT in SD male rats of different months, and analyze their changes with the increase of age and the correlation with aging bone mass loss. Methods Six male SD rats at the age of 2, 6, 12, 15 and 18 months respectively (30 in total) were selected in this study for each group and they were grouped according to their ages so as to simulate the physiological aging model. RT-PCR and Western blot methods were employed respectively in this study to detect the mRNA and the expression of protein level of duodenal TPH1, LRP5 in rats of different months. Moreover, the ELISA method was used to check the level of serum 5-HT and the Dual-energy bone mineral density method was used to determine the bone mineral density of rats’ femurinvitro. Results Both the expression level of the duodenal TPH1 mRNA and protein as well as the level of serum 5-HT increased with the growth of the age, but they showed the negative correlation with the aging bone mass loss(P<0.001). Conclusions The enterogenous 5-HT and the expression of TPH1, which is the key enzymes for the speed limit, play an important role in the aging bone mass loss, and they might become the new potential treatment and intervention targets for senile osteoporosis.

LRP5；TPH1；5-HT；senile osteoporosis

2014- 10- 27

2015- 03- 22

重庆市渝中区科委基金(20110405)

1001-6325(2015)07-0934-04

R681

A

*通信作者(corresponding author)：iygnituh@foxmail.com