男性不育患者Y染色体微缺失与性激素水平相关

汪 明，乔 斌，李 雯，李 艳*

(武汉大学人民医院1.检验科;2.血液科，湖北 武汉430060)

大约10%～15%的精子缺陷和男性不育是由遗传因素引起的，其中Y染色体微缺失是引起男性不育的主要遗传因素之一，尤其是Y染色体长臂(Yq)端无精子因子(azoospermia factor，AZF)区域的微缺失[1]。目前，AZF 划分为4个互不重叠区域，即AZFa、AZFb、AZFc 和AZFd，该区域的缺失和性激素水平均影响男性的正常生精功能[2]。本实验对Y染色体微缺失模式及与性激素水平之间关系的进行研究，为临床男性不育的诊断和治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

2009年7月至2014年7月在武汉大学人民医院就诊的男性不育患者789例，其中严重少精子症患者164例，无精子症患者194例。同时选取正常男性100例为对照组。精液分析参照第5版WHO人类精液检查与处理手册进行，其中连续3次精液检查并离心检测均未发现精子的男性为无精子症患者(均为非梗阻性无精子症患者);严重少精子症患者为3次精液分析，精子浓度均＜5×106/mL。对照组为2次精液分析结果均正常的生育男性(精液量2～7 mL，精子浓度＞2×107/mL，精子总数＞4×107/mL，活动率＞60%;活动度:3级，大部分呈直线运动;正常形态精子大于50%;白细胞＜10/HP)。抽取检测者外周血标本进行Y染色体微缺失检测和性激素水平的检测。

1.2 方法

1.2.1 外周血DNA 提取:核酸提取采用上海莱枫生物科技有限公司生产的细胞/血液基因组DNA 快速提取试剂盒，提取过程严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.2 PCR引物设计:根据NCBI 提供的STS 引物序列和参考文献合成引物[3]，引物由Invitrogen 公司合成，引物序列见表1。

1.2.3 Y染色体微缺失检测:以多重PCR的方法，参考欧洲男科协会(European Academy of Andrology，EAA)2004版指导原则和欧洲分子遗传实验质控网(European Molecular Genetics Quality Network，EMQN)标准，检测的Y染色体AZF区域的15个序列标签位点(sequence tagged sites，STS):Ⅰ组:SY254、SY143、SY242和SY255;Ⅱ组:SY84、SY239和SY152;Ⅲ组:SY86、SY127、SY145 和SY124;Ⅳ组:SY134、SY82、SY128 和SY133;共设计15 对引物和一对内对照引物，利用PCR 技术可从Y染色体上特异性扩增出15条非多态性短片段的序列标签位点(STS)和1条内对照基因片段。这些引物对分别组合成4 套多重PCR 系统，在相同条件下，进行4 管PCR扩增反应，通过琼脂糖凝胶电泳结果判定15个STS的存在与否。

1.2.4 生殖激素水平检测:用全自动化学发光免疫分析仪及试剂盒检测性激素水平，严格按照仪器要求和试剂盒说明书进行操作。男性促卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)正常参考值1.4～18.1 mIU/mL，促黄体生成素(luteinizing hormone，LH)正常参考值1.5～9.3 mIU/mL，睾酮(testosterone，T)正常参考值为241～827 ng/dL。

1.3 统计学分析

数据采用SPSS 19.0 进行分析。计量资料采用独立样本t 检验对数据进行分析。

2 结果

2.1 Y染色体微缺失分布

789例男性不育患者中共发现40例Y染色体微缺失，占5.1%。其中无精子症患者194例，Y染色体微缺失27例，占13.9%;严重少精子症患者164例，Y染色体微缺失12例，占7.3%;1例精液浓度＞5×106/mL的Y染色体微缺失患者。Y染色体微缺失检测(图1)。

图1 Y染色体微缺失检测电泳图Fig1 Electrophoretogram of Y chromosome microdeletion

2.2 Y染色体微缺失模式

39例Y染色体微缺失患者中(无精/少精)，共发现66次Y染色体微缺失(1个患者可有多个位点缺失)，其中AZFc区缺失最常见，占77.3%;SY254+SY255 为最常见缺失模式，占53.8%。Y染色体微缺失模式及分布(表2)。

2.3 Y染色体微缺失与性激素水平之间的关系

AZF区缺失不育患者组、无AZF区缺失不育患者组、正常男性对照组性激素水平进行比较，AZF区缺失不育患者组FSH 水平明显高于其他两组，无AZF区缺失不育患者FSH 较对照组显著增高(P＜0.05)(表3)。

表2 Y染色体微缺失模式Table2 Models of Y chromosome microdeletion

表3 不同组患者性激素水平比较Table3 Comparation of gonadal hormone levelsin different groups (±s)

表3 不同组患者性激素水平比较Table3 Comparation of gonadal hormone levelsin different groups (±s)

*P＜0.05 compared with control;#P＜0.05 compared with infertility patients without AZF deletion.

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3 讨论

世界上目前大约有10%～15%的育龄夫妇不育，50%是由男性因素引起[4]。无精子症或少精子症是男性不育中最常见的因素，其中约20%的患者为非梗阻性无精子症或少精子症，患者大多具有正常的Y染色体形态但可能具有AZF区域的微小缺失。Y染色体在精子生成过程中发挥重要作用，Y染色体上特殊基因的缺失、突变等异常均可影响正常生精功能。AZF区微缺失在男性不育患者中的平均发生率约为8%，但存在地域差异[5]。不同研究中Y染色体微缺失的发生率差异较大，介于1%～55%[6]。这可能由于受试者纳入或排除标准不一致所致，也有可能是因为选取STS 标记位点及位置不同或实验室检查方法不一致等。

本研究中，789例男性不育患者共检出AZF区缺失40例，缺失率为5.1%，其中358例无精与严重少精症患者中AZF 总缺失率为10.9%。以AZFc和AZFb 缺失常见，AZFa 和AZFd 缺失少见，与其他研究者的报道基本一致[7-8]。最常见微缺失模式为AZFc区SY254+SY255 缺失，占53.8%。患者也可表现为多个区域的联合缺失，如SY86+SY134 缺失。AZF 基因与精子生成密切相关，该基因位点的缺失可导致原发性无精或不同程度的少精，发生微缺失的区域不同，相应的临床表型也有所不同。

性激素也在男性生殖活动中发挥着重要作用。性激素水平受下丘脑-垂体-性腺轴调节，任何原因引起性激素分泌轴功能紊乱，均可引起男性不育。本研究发现，Y染色体微缺失患者和无微缺失患者的FSH 水平均显著升高而LH 和T 则无明显改变。可能是由于Y染色体微缺失引起曲细精管中精子生成能力下降和成熟障碍，使下丘脑-垂体-性腺轴功能紊乱，不能分泌足够的抑制素去调节FSH的浓度，致使FSH浓度明显上升，而LH 和T 无明显影响。这与报道[9]的结果相似，但有些研究[10]却得到相反的结果，认为Y染色体微缺失患者的FSH值与无微缺失的患者相比明显降低。这说明Y染色体微缺失与性激素之间的关系并不十分明确，仍需进一步研究。

Y染色体微缺失模式、性激素水平改变及染色体核型异常等因素均与男性不育密切相关，其机制十分复杂，还需进一步研究。无精子症和严重少精子症不育患者进行相关检查对治疗有重要参考价值。

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