甲型副伤寒沙门菌ompN基因原核表达系统构建及其产物免疫保护作用

金 蕾，孙爱华，胡玮琳，葛玉梅，林旭瑷

甲型副伤寒沙门菌ompN基因原核表达系统构建及其产物免疫保护作用

金 蕾1，孙爱华2，胡玮琳1，葛玉梅1，林旭瑷1

目的 了解甲型副伤寒沙门菌外膜蛋白ompN基因携带率及其重组表达产物抗原性和免疫保护作用。方法 采用PCR扩增甲型副伤寒沙门菌参考标准株50001及126株临床菌株ompN基因并测序。构建ompN基因原核表达系统，Ni-NTA亲和层析法提取目的重组蛋白rOmpN。采用家兔免疫法和ELISA检测rOmpN免疫原性。微量肥达试验和激光共聚焦显微镜法分别检测OmpN在甲型副伤寒沙门菌株中表达率及其膜定位。采用小鼠感染模型了解rOmpN对甲型副伤寒沙门菌致死性感染的免疫保护作用。结果 所有甲型副伤寒沙门菌株中均扩增出全长ompN基因片段，其核苷酸和氨基酸序列相似性分别高达98.6%～99.9%和98.7%～100%。OmpN是甲型副伤寒沙门菌跨膜蛋白。ompN基因表达系统能表达rOmpN，免疫家兔后能产生高效价抗血清。98.2%(55/56)甲型副伤寒病人血清标本中rOmpN-IgG阳性，rOmpN兔抗血清能有效凝集甲型副伤寒沙门菌。100和200 μg rOmpN对感染小鼠的免疫保护率分别为60.0%(9/15)和73.3%(11/15)。结论 甲型副伤寒沙门菌ompN基因分布广泛且序列保守， rOmpN有较强的抗原性和免疫保护作用。

甲型副伤寒沙门菌；ompN基因；重组表达；抗原性；免疫保护性

伤寒和副伤寒是我国重点监控的消化道传染性疾病[1]。早年我国人群中伤寒沙门菌(Salmonellatyphi)感染引起的伤寒发病率较高，但近年我国不少地区甲型副伤寒沙门菌(S.paratyphiA)感染引起的甲副伤寒发病率显著增高，江苏、云南、江西、广西和浙江等地区甚至出现甲副伤寒暴发流行[2-5]。北美、欧洲尤其是东南亚地区近年甲副伤寒病例也显著增加，故甲副伤寒的流行被认为是当前人类面临的重要公共卫生问题之一[6-9]。

伤寒和副伤寒多价全菌死疫苗因副作用较大早已停用，近年我国使用伤寒沙门菌荚膜多糖抗原制备的Vi疫苗进行预防接种。由于甲型副伤寒沙门菌不产生荚膜，故Vi疫苗对该菌感染无保护作用[9-11]。因此，研发甲副伤寒疫苗对于预防和控制甲副伤寒流行均具有重要意义[12]。本研究中我们检测了ompN基因在甲型副伤寒沙门菌临床菌株中的携带和表达率，构建了ompN基因原核表达系统并检测了表达的目的重组蛋白rOmpN免疫原性及其对感染小鼠免疫保护作用，以期为rOmpN作为甲型副伤寒多价基因工程疫苗候选抗原提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株和血清标本 甲型副伤寒沙门菌参考标准株50001购自北京中国药品生物制品检定研究院。126株甲型副伤寒沙门菌临床菌株、56份甲副伤寒病人恢复期血清分别由浙江省宁波市、温岭市和杭州市疾病预防控制中心提供，15份微量肥达试验结果阴性的健康体检者血清由浙江省新华医院提供。

1.2ompN基因扩增及测序 采用细菌基因组DNA提取试剂盒(Axygen)提取上述甲型副伤寒沙门菌基因组DNA，紫外分光光度法测定其浓度[13]。根据GenBank中甲型副伤寒沙门菌ATCC9150株ompN基因序列(accession No.：CP000026)及其限制性核酸内切酶位点分析结果[14]，设计PCR引物并由上海Invitrogen公司合成。上游引物：CGC CAT ATG (Nde I) atg aaa aga aaa gta ttg gca-3′，下游引物：CGC CTC GAG (Xho I) gaa ctg gta aac cat acc cag-3′。以100 ng甲型副伤寒沙门菌DNA为模板，采用PCR扩增全长ompN基因片段，反应参数：94 ℃5 min；94 ℃30 s、52 ℃30 s、72 ℃60 s，30个循环；72 ℃10 min。扩增产物经溴乙锭预染色的1.5%琼脂糖凝胶电泳法检查后，采用T-A克隆试剂盒(TaKaRa)将其克隆入pMD-19-T中形成重组质粒pMD-19-TompN，委托上海Invitrogen公司测序。采用BLAST软件比对不同甲型副伤寒沙门菌株ompN基因核苷酸和氨基酸序列相似性。

1.3ompN基因原核表达系统构建及鉴定 甲型副伤寒沙门菌50001株pMD-19-TompN与原核表达载体pET42a(Novagen)用Nde I和Xho I(TaKaRa)双酶切，回收目的条带后用紫外分光光度法测定其浓度[13]。300～500 ng的ompN基因片段与100 ng线性化 pET42a混合，在T4 DNA连接酶(TaKaRa)作用下形成重组表达载体pET42aompN。采用CaCl2法将pET42aompN转化入表达宿主菌E.coliBL21DE3(Novagen)形成工程菌株E.coliBL21DE3pET42a-ompN [13]。该菌株接种于含50 μg/mL卡那霉素(Kan)LB平板(Oxoid)上37℃培养18 h，挑取白色菌落在Kan-LB培养液中37°C振荡培养4～6 h增菌，用细菌质粒提取试剂盒(Axygen)提取 pET42aompN后再次测序。

1.4 rOmpN表达与提纯E.coliBL21DE3pET42a-ompN接种于Kan-LB培养液(Oxoid)中，37 ℃振荡培养 2 h，加入0.5 mmol/L IPTG(Sigma)后30 ℃振荡培养4～6 h，以诱导rOmpN表达。采用Ni-NTA 亲和层析柱(BioColor)提取表达的rOmpN，BCA蛋白定量试剂盒(Beyotime Biotech)和SDS-PAGE分别检测其浓度和纯度[13]。

1．5 rOmpN抗血清制备 1 mg rOmpN与弗氏完全佐剂混合后皮内多点免疫家兔4 次，每次间隔一周，末次免疫后两周采集心血并分离血清，采用免疫扩散法测定其效价。

1．6 OmpN膜结构分析与定位 根据测序结果用TMHMM Server v. 2.0软件分析ompN基因产物的膜结构。采用1∶500稀释的rOmpN兔抗血清为一抗、1∶2 000稀释的Alexa-Fluor568标记羊抗兔IgG(Invitrogen)为二抗，采用激光共聚焦显微镜法检测甲型副伤寒沙门菌50001株OmpN的膜定位，实验中以正常兔血清为对照。

1．7 微量肥达试验 常规离心收集新鲜培养的甲型副伤寒沙门菌50001株及其126株临床菌株并悬于0.01 mol/L PBS(pH7.4)中，用比浊法配制成1.5×108的细菌悬液。将0.25 mL细菌悬液与0.25 mL 1∶5、1∶25或1∶50稀释的rOmpN兔抗血清混匀，37 ℃孵育过夜，若50%细菌被凝集判为阳性[15]。实验中采用正常兔血清作为对照。

1．8 ELISA 96孔酶标板中每孔加入0.01 mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.3)配制的10 μg/mL rOmpN溶液0.1 mL，4 ℃包被过夜。次日吸弃各孔液体，用0.5% Tween 20-PBS洗板3次，加入10%小牛血清-PBS 37 ℃封闭1 h，按上法再次洗板。分别以1∶100或1∶500稀释的甲型副伤寒恢复期病人血清为一抗、1∶3 000稀释的HRP标记羊抗人IgG(Invitrogen)为二抗、OPD为底物，显色后用酶标仪(Bio-Rad)检测各孔OD450值。实验中以相同稀释度的15份微量肥达试验结果阴性健康体检者血清OD450均值+3SD为cut-off值，病人血清标本OD450值大于cut-off值者判为阳性[15]。

1．9 小鼠免疫保护试验 将体重(19±1)g清洁级BALB/c小鼠分为5 组，每组10只，分别腹腔注射不同浓度甲型副伤寒杆菌50001株悬液0.5 mL，观察7 d，以获得100%最低致死量(MLD)。将BALB/c小鼠分为3组，每组15只，颈背部皮下分别注射100或200 μg rOmpN与1 mg氢氧化铝佐剂(Sigma)混合物(试验组)或200 μg牛血清白蛋白(BSA，Sigma)与1 mg氢氧化铝混合物(对照组)，间隔一周后按上法再次免疫[1,16]。末次免疫后2周，每只小鼠腹腔注射2倍100%MLD甲型副伤寒杆菌50001株进行攻击，观察并记录7 d内动物死亡情况。

2 结 果

2．1ompN基因携带率及其序列分析结果 甲型副伤寒沙门菌50001株及其126株临床菌株DNA中均能扩增出全长ompN基因片段(图1)，各菌株ompN基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别高达98.6%～99.9%和98.7%～100%。

2．2 rOmpN表达及提纯效果 在0.5 mmol/L IPTG诱导下，E.coliBL21DE3pET42a-ompN能有效表达rOmpN，Ni-NTA 亲和层析法提取的rOmpN在分离胶中显示为单一的蛋白条带(图2)。

2.3 OmpN膜定位 膜结构分析结果显示，OmpN为跨膜蛋白，除N端约25个氨基酸残基序列分别位于甲型副伤寒沙门菌膜内或跨膜外，其余均位于膜外(图3)。激光共聚焦显微镜检测结果显示，OmpN定位于甲型副伤寒沙门菌表面(图4)。

2.4 rOmpN免疫原性及OmpN表达率 rOmpN免疫家兔后能产生高效价血清抗体，该抗血清与rOmpN免疫扩散效价高达1∶16。ELISA检测结果显示，1∶100(cut-off值0.225)或1∶500(cut-off值0.156)稀释的甲副伤寒病人血清标本rOmpN-IgG阳性率分别为98.2%(55/56)和92.8%(55/56)。

M：DNA marker；1：空白对照；2-6：分别为甲型副伤寒沙门菌50001参考标准株和4株甲型副伤寒沙门菌临床代表株ompN基因扩增条带

Lane M: DNA marker; Lane 1: blank control; Lanes 2-6: the amplification fragments ofompNgene from reference standard strain 50001 and four representative clinical strains ofS.paratyphiA.

图1 甲型副伤寒沙门菌ompN基因PCR检测结果

Fig.1 PCR detection result ofompNgene inS.paratyphiA strains

M：蛋白 marker；1：野生型pET42a空白对照；2和3：分别为表达和提纯的rOmpN

Lane M: protein marker; Lane 1: blank control of wild-type pET42a; Lanes 2 and 3: expressed and extracted rOmpN, respectively.

图2 甲型副伤寒沙门菌rOmpN表达及提取效果

Fig.2 Effects of rOmpN expression and extraction ofS.paratyphiA

图3 甲型副伤寒沙门菌OmpN膜结构分析结果

Fig.3 Analytic result of membrane structure in OmpN ofS.paratyphiA

A：rOmpN兔抗血清为一抗时OmpN膜定位；B：正常兔血清为一抗的阴性对照

A: The location of OmpN in membrane using rabbit anti-rOmpN serum as the primary antibody;B: The negative control using normal rabbit serum as the primary antibody.

图4 甲型副伤寒沙门菌OmpN膜定位(×1500)

Fig.4 Location of OmpN in membrane ofS.paratyphiA

微量肥达试验结果显示，99.2%(125/126)、80.1%(101/126)和68.3%(86/126)甲型副伤寒沙门菌临床菌株分别能与1∶10、1∶50和1∶100稀释的rOmpN兔抗血清发生凝集反应。

2．5 小鼠免疫保护试验结果 BSA免疫小鼠腹腔感染2倍100% MLD甲型副伤寒杆菌50001株(1×107)后7 d内均死亡。60.0%(9/15)100 μg rOmpN免疫小鼠、73.3%(11/15)200 μg rOmpN免疫小鼠经2倍100% MLD甲型副伤寒杆菌50001株攻击后仍存活P<0.05,表1。

2 讨 论

新发传染病(emerging infection disease)和再发传染病(re-emerging infection disease)是威胁人类健康和生命安全的重大疾病。伤寒和副伤寒又称肠热症，前者为伤寒沙门菌(Salmonellatyphi)感染所致，后者分为甲、乙、丙副伤寒，分别为甲型副伤寒沙门菌、肖氏沙门菌(S.schottmuelleri)和希氏沙门菌(S.hirschfeldii)感染所致。以往我国及东南亚地区主要流行伤寒，欧美地区伤寒和副伤寒病例极为少见[2-9]。如前所述，甲型副伤寒沙门菌不产生多糖荚膜，故伤寒沙门菌荚膜多糖为抗原的Vi疫苗免疫筛选作用以及甲型副伤寒沙门菌耐药性日益增强，被认为是目前甲副伤寒全球性流行的主要原因[17]。因此，甲副伤寒被认为是一种新发或再发传染病[18]。

表1 rOmpN对甲型副伤寒杆菌感染小鼠的免疫保护作用

伤寒尤其是副伤寒存在无症状带菌者，部分伤寒或副伤寒病人呈慢性感染，但均可通过粪便排菌感染他人，故伤寒或副伤寒是典型的人与人之间传播性传染病，故接种疫苗被认为是预防和控制伤寒或副伤寒流行最为有效的措施[10]。早年伤寒、甲与乙副伤寒三联全菌死疫苗因其脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)毒副作用严重而被不含LPS的Vi疫苗所替代[19]。沙门菌是革兰阴性菌，其外膜蛋白可作为基因工程疫苗抗原[20]。因此，研发以甲型副伤寒沙门菌外膜蛋白为抗原的多价基因工程疫苗是预防和控制目前甲副伤寒流行的有效途径。

作为细菌基因工程疫苗的蛋白抗原，必须表达于细菌表面、序列保守、分布广泛且有较强的免疫原性[20]。外膜的实验结果显示，甲型副伤寒沙门菌OmpN是位于菌体表面的跨膜蛋白，所有126株甲型副伤寒沙门菌临床菌株均携带ompN基因且有很高的核苷酸和氨基酸序列相似性(98.6%～100%)。甲型副伤寒沙门菌ompN基因重组表达产物rOmpN免疫家兔获得的抗血清，其免疫扩散效价可达1∶16；甲副伤寒病人血清标本1∶100稀释时，高达98.2%(55/56)的标本可检出rOmpN-IgG。肥达试验的本质是伤寒或副伤寒抗体血清与菌体表面抗原结合的免疫凝集反应。我们的微量肥达试验结果显示，1∶10稀释的rOmpN兔抗血清能凝集99.2%(125/126)甲型副伤寒沙门菌临床菌株，提示这些菌株均表达OmpN。因此，甲型副伤寒沙门菌ompN是分布广泛且序列保守的外膜蛋白基因，OmpN是高表达且有较强免疫原性的外膜蛋白抗原。

动物保护试验是确定任一蛋白能否作为基因工程疫苗候选抗原的关键。我们的小鼠免疫保护试验结果显示，100或200 μg rOmpN免疫的小鼠能抵抗甲型副伤寒杆菌50001株致死性攻击而存活，但通常疫苗免疫保护率达到90%以上才能令人满意。目前认为，与抗原构造较为简单的病毒不同，细菌是抗原构造复杂多样的原核细胞型微生物，单一细菌蛋白抗原的抗体作用靶点极为有限，难以获得理想的免疫保护效果，必须同时采用多种细菌表面蛋白同时作为免疫原，才有可能获得良好的免疫保护效果[20]。因此，rOmpN可作为甲型副伤寒杆菌有效抗原之一，与我们以往证实的rSpaO和rH1a抗原联合应用[1,11]，从而研制出高效多价甲副伤寒基因工程疫苗。

[1]Ruan P, Xia XP, Sun D, et al. Recombinant SpaO and H1a as immunogens for protection of mice from lethal infection withSalmonellaparatyphiA: Implications for rational design of typhoid fever vaccines[J]. Vaccine, 2008, 26(51): 6639-6644. DOI:10.1016/j.vaccine.2008.09.030

[2]Wang HQ, Pan JC, Ge YM, et al. Molecular characteristics ofSalmonellatyphiandSalmonellaparatyphiA isolates in Hangzhou area[J]. Chin J Microbiol Immonol, 2012, 32(8): 711-715 (in Chinese) 汪皓秋，潘劲草，葛玉梅，等. 杭州地区伤寒及副伤寒沙门菌流行菌株分子特征的研究 [J]. 中华微生物学和免疫学杂志，2012, 32(8):711-715.

[3]Yan MY, Liang WL, Li W, et al. Epidemics of typhoid and paratyphoidfever from 1995 through 2004 in China[J]. Dis Surveill, 2005, 20(8): 401-403 (in Chinese) 闫梅英，梁未丽，李伟，等. 1995-2004全国伤寒副伤寒的流行分析 [J]. 疾病监测，2005, 20(8):401-403.

[4]Bao CJ, Zhuang L, Song L, et al. Surveillance and epidemiological analysis on the epidemic of typhoid and paratyphoid salmonella during the years from 2001-2003 in Jiangsu Province[J]. Jingsu Prev Med, 2004, 15(4): 6-9. (in Chinese) 鲍倡俊，庄菱，宋俐，等. 江苏省2001-2003年伤寒副伤寒监测及流行病学分析 [J]. 江苏预防医学，2004, 15(4):6-9.

[5]Chu CJ, Kong FL, Wu HL, et al. Epidemiological survey of paratyphoid fever A in 3888 patients[J]. Med Pharm Yunnan, 2008, 29(1): 57 (in Chinese) 储从家，孔繁林，吴惠玲，等. 3 888例甲型副伤寒流行病学调查 [J]. 云南医药，2008, 29(1):57.

[6]Verma S, Thakur S, Kanga A, et al. EmergingSalmonellaParatyphiA enteric fever and changing trends in antimicrobial resistance pattern ofsalmonellain Shimla[J]. Indian J Med Microbiol, 2010, 28(1): 51-53. DOI:10.4103/0255-0857.58730

[7]Gupta SK, Medalla F, Omondi MW, et al. Laboratory-based surveillance of paratyphoid fever in the United States: travel and antimicrobial resistance[J]. Clin Infect Dis, 2008, 46(11): 1656-1663. DOI:10.1086/587894

[8]Pandit A, Arjyal A, Paudyal B, et al. A patient with paratyphoid A fever: an emerging problem in Asia and not always a benign disease[J]. J Travel Med, 2008, 15(5): 364-365. 10.1111/j.1708-8305.2008.00238.x

[9]Michel R, Garnotel E, Spiegel A, et al. Outbreak of typhoid fever in vaccinated members of the French Armed Forces in the Ivory Coast[J]. Eur J Epidemiol, 2005, 20(7): 635-642. DOI:10.1007/s10654-005-7454-6

[10]Yan J. Medical microbiology[M]. 2nd Ed. Beijing: High-education Publication House, 2012: 109-111. (in Chinese) 严杰. 医学微生物学[M]. 2版.北京：高等教育出版社，2012, 109-111.

[11]Jin L, Jiang JQ, Fang JQ, et al. Construction of a h1a-spaO fusion gene ofSalmonellaparatyphiA and immunoprotection of product expressed by the fusion gene[J]. Chin J Microbiol Immunol, 2014, 34(9): 702-706. (in Chinese) 金蕾，蒋锦琴，方佳琪，等. 甲型副伤寒沙门菌 h1a-spaO 融合基因构建及其表达产物免疫保护作用[J]. 中华微生物学和免疫学杂志，2014, 34(9):702-706.

[12]Fangtham M, Wilde H. Emergence ofSalmonellaparatyphiA as a major cause of enteric fever: need for early detection, preventive measures, and effective vaccines[J]. J Travel Med, 2008, 15(5): 344-350. DOI:10.1111/j.1708-8305.2008.00237.

[13]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning, a latoratory manual[M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989: 1.21-1.52,2.60-2.80,7.30-7.35, 9.14-9.22.

[14]McClelland M, Sanderson KE, Clifton SW, et al. Comparison of genome degradation in Paratyphi A and Typhi, human-restricted serovars ofSalmonellaentericathat cause typhoid[J]. Nat Genet, 2004, 36(12): 1268-1274. DOI:10.1038/ng1470

[15]Chart H, Cheasty T, de Pinna E, et al. Serodiagnosis ofSalmonellaentericaserovar Typhi andS.entericaserovars Paratyphi A, B and C human infections[J]. J Med Microbiol, 2007, 56(Pt9): 1161-1166. DOI:10.1099/jmm.0.47197-0

[16]Luo DJ, Xue F, Ojcius DM, et al. Protein typing of major outer membrane lipoproteins from Chinese pathogenicLeptospiraspp. and characterization of their immunogenicity[J]. Vaccine, 2010, 28(3): 243-255. DOI:10.1016/j.vaccine.2009.09.089

[17]Crump JA, Mintz ED. Global trends in typhoid and paratyphoid fever[J]. Clin Infect Dis, 2010, 50(2): 241-246. DOI:10.1086/649541

[18]Wilde H. Enteric fever due toSalmonellatyphiandparatyphiA: A neglected and emerging problem[J]. Vaccine, 2007, 25(29): 5246-5247. DOI:10.1016/j.vaccine.2007.04.053

[19]Engels EA, Falagas ME, Lau J, et al. Typhoid fever vaccines: a meta-analysis of studies on efficacy and toxicity[J]. Brit Med J, 1998, 316(7125): 110-116. DOI:10.1136/bmj.316.7125.110

[20]Sun AH, Fang JQ, Yan J. Advance and development in research of bacterial drug-resistance signaling mechanism and multiple antigenic peptide-based vaccines[J]. J Zhejiang Univ:Med Ed, 2013, 42(2): 125-130. (in Chinese) 孙爱华，方佳琪，严杰. 病原菌耐药信号传导机制及多抗原肽疫苗研究进展与发展趋势 [J]. 浙江大学学报:医学版，2013, 42(2):125-130.

Lin Xü-ai; Email: lxai122@163.com

Construction ofompNgene prokaryotic expression system ofSalmonellaparatyphiA and immunoprotection of its expressed product

JIN Lei1,SUN Ai-hua2，HU Wei-lin1,GE Yu-mei1,LIN Xü-ai1

(1.DepartmentofMedicalMicrobiologyandParasitology,SchoolofMedicine,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China;2.FacultyofBasicMedicine,ZhejiangMedicalCollege,Hangzhou310053,China)

The aim of this study is to detect theompNgene carrying rates inSalmonellaparatyphiA strains and to determine the antigenicity and immunoprotection of its recombinant expression product. Briefly, PCR was used to amplify theompNgene in the reference standard strain 50001 and 126 isolates ofS.paratyphiA, and then the amplified products were sequenced. AnompNgene prokaryotic expression system was generated and the target recombinant protein rOmpN was extracted by Ni-NTA affinity chromatography. The antigenicity of rOmpN was detected by rabbit immunization and ELISA. Micro-Widal’s test and laser confocal microscopy were applied to determine the expression rate of OmpN in theS.paratyphiA strains and its membrane location, respectively. A mouse infection model was used to investigate the immunoprotection of rOmpN in mice challenged by lethal dose ofS.paratyphiA. Results demonstrated that the entireompNgene fragment could be amplified from all theS.paratyphiA strains. The nucleotide and amino acid sequence identities of theompNgenes were as high as 98.6%-99.9% and 98.7%-100%, respectively. OmpN is a transmembrane protein ofS.paratyphiA. TheompNgene expression system could express rOmpN and the rOmpN-immunized rabbits produced high-titer antiserum. The 98.2% (55/56) of the paratyphoid A patients’ serum samples were positive for rOmpN-IgG and the rabbit anti-rOmpN serum could efficiently agglutinate theS.paratyphiA strains. The immunoprotective rate of 100 or 200 μg rOmpN-immunized mice were 60.0% (9/15) or 73.3% (11/15). All the data indicated thatompNgene ofS.paratyphiA has an extensive distribution and a high sequence conservation and its recombinant expression product rOmpN has powerful immunogenicity and immunoprotection.

SalmonellaparatyphiA;ompNgene; recombinant expression; antigenicity; immunoprotection

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.005

林旭瑷，Email:lxai122@163.com

1.浙江大学医学院病原生物学系，杭州 310058； 2.浙江医学高等专科学校基础医学部，杭州 310053

Supported by the Zhejiang Provincial Program for the Cultivation of High-level Innovative Health Talents (No. [2012]241)

R378

A

1002-2694(2015)08-0709-05

2015-01-03；

2015-03-16

浙江省卫生高层次创新人才项目基金(No.[2012]241)资助