湖南老年医院首例恙虫病多器官受累病例实验室分析

朱黎明，王 勇，黄 进，戴爱国，罗 曼，胡 芳，张丽娟

湖南老年医院首例恙虫病多器官受累病例实验室分析

朱黎明1，王 勇2,3，黄 进1，戴爱国1，罗 曼1，胡 芳1，张丽娟2

目的 对湖南老年医院首例恙虫病可疑病例进行实验室快速诊断及病原分子流行病学分析。方法 病人急性期及恢复期血清恙虫病IgM、IgG抗体进行胶体金快速定性及ELISA定量。环介导等温扩增(LAMP)病人血液及焦痂恙虫病东方体56KD 基因及巢氏PCR扩增热休克蛋白基因(groEL)并分析groEL遗传进化关系。结果 病人发热期(发病24天)及恢复期(发病32天)血清IgM、IgG抗体定性试验均为阳性，ELISA定量试验双份血清IgM、IgG抗体滴度均达1∶2 560。急性期血液及焦痂DNA样本LAMP检测及巢氏PCR扩增groE阳性。结论 本报道为湖南老年医院首例恙虫病病例报道。应加强立克次体病诊断及鉴别诊断。

恙虫病;恙虫病东方体;多器官受累;实验室调查

XinjiangProvince,People’sRepublicofChina)

恙虫病(scrub typhus)是严重威胁亚太平洋地区公共卫生健康的媒介源性立克次体病[1-2]。临床以高热、虫媒叮咬焦痂或溃疡、淋巴结肿大及皮疹为特征[3-4]。该病易误诊，导致多器官衰竭，甚至死亡[5-6]。1986年前，恙虫病主要分布我国长江以南，此后，北方多地报道该病流行及临床病例[7-9]。本文就湖南老年医院首例恙虫病临床诊断病例实验室快速诊断作以报告。

1 病例调查及标本采集患者

2014年10月20日，男性,以发热、头痛、伴呕吐入院。52岁,江华瑶族自治县人。入院系统检查显示多器官损伤。实验室检查WBC升高、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿酸、乳酸脱氢酶、C反应蛋白及血沉均表现升高。常见的发热性感染性疾病包括病毒类感染、细菌性感染实验室检测均为阴性。常规抗病毒、抗细菌、抗真菌治疗无效。因病人曾有野外活动史，查体显示阴囊下有虫咬焦痂。考虑恙虫病并给予多西环素治疗，2 d后发热停止，实验室各项指标恢复正常出院。病人发热期10月31日间采集第一份血液标本并分离血清及血块-20 ℃保存，同时采集焦痂组织标本。11月10日采集恢复期标本分离血清并送中国CDC传染病所无形体室进行检测。

2 实验室检测分析

2.1 血清学检测 发热期及恢复期血清标本同时检测恙虫病东方体IgM和IgG抗体。快速定性检测使用美国InBios国际有限公司快速胶体金诊断试剂(scrub typhus detectTMIgG, LOT#:NB 46/80; scrub typhus detectTMIgM, LOT#:46/81。定量试验使用同公司ELISA诊断试剂盒(scrub typhus detectTMIgM ELISA, LOT#:PD 1173; scrub typhus detectTMIgG ELISA, LOT#:STGS-1)。

2.2 环介导等温扩增(LAMP)恙虫病东方体56 KD蛋白基因 发热期、恢复期血块及焦痂组织DNA提取使用德国QIAGEN公司DNA提取试剂盒(Cat. No. 69506)。正常人血液及无菌水同时操作作为阴性对照；恙虫病东方体kato型(WHO立克次体协作中心惠赠)DNA作为阳性对照。LAMP引物：FIP(5′- GTCACCGCAACATTTGCATCTG-GTAACACTGCAGGTGTGAT-3′)，BIP(5′- TACAGCAATTGAAGCATCAGGT-TCCTAAACGTAACTCGGC-3′)，F3(5′- TGCCRTT

TTCAGCTAGTG-3′)，B3(5′- TKGMGCRATTGTCATACC-3′)，LB(5′- AACRCTTGYCATTAACAACCGG-3′)。LAMP总反应体积 25 μL包含有1.6 μmol/L FIP 和BIP引物, 0.8 μmol/L LF和LB 引物, 0.2 μmol/L F3和B3引物, 20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8),10 mmol/L KCl,8 mmol/L MgSO4, 10 mmol/L(NH4)2SO4, 0.1% 土温-20, 0.8 mol/L甜菜碱, 1.4 mmol/L dNTP和1 μLBstDNA聚合酶 (8 U/μL)。反应在LAMP实时浊度仪(model LA200, Teramecs, Tokyo, Japan) 63 ℃恒温下作用 60 min， 然后 80 ℃作用5 min。 反应产物以2% 琼脂糖凝胶电泳。所有标本独立平行操作2次。

2.3 PCR扩增热休克蛋白groEL基因及序列分析 巢式PCR检测血快及焦痂组织恙虫病东方体groEL基因[10]。外引物Gro-1：5′- AAG AAG GA/CGT GAT AAC-3′；外引物Gro-2：5′-ACT TCA/CGT AGC ACC-3′；内引物TF-1：5′-ATA TAT CAC AGT ACT TTG CAA C-3′；内引物TR-2：5′-GTT CCT AAC TTA GAT GTA TCA T-3′。反应体系及PCR反应条件按文献进行[10]。预期片段为364 bp。产物送北京擎科新业生物技术有限公司双向测序。应用Blast平台，将所测序列同源比较并用Mega5.0软件构建进化树。

3 结 果

3.1 血清学 发热期及恢复期血清胶体金定性检测IgM和IgG抗体均阳性。ELISA定量检测上IgM和IgG抗体滴度均为1∶2 560。

3.2 LAMP检测 独立平行2次LAMP检测发热期及及恢复期血块及焦痂标本,结果显示发热期血块、焦痂组织呈阳性，而恢复期血块阴性(图1)。

M:DNA标准；泳道1：发热期血块，泳道2：恢复期血块，泳道3：焦痂组织，泳道4：阳性对照，泳道5：阴性对照。

图1 LAMP检测结果

Fig.1 LAMP results of patient’s blood DNA and eschar DNA

3.3groEl基因扩增及序列分析 病人发热期及焦痂组织groEl基因扩增阳性，并且2种标本检出序列100%同源(328 bp)。而恢复期血液标本检测阴性。检出序列暂命名为Hunan1。Blast同源比较及进化分析发现本试验检出序列与泰国UT125株，Gilliam型(EF551293)，2049株，Gilliam型(EF551291)[11]、日本福岛02株(KC688330)及埼玉市捕捉的大林姬鼠(Apodemusspeciosus)UAP2株(KC688329)检出序列[12]100%同源(图2)。此外，与我国近年北方地区如北京郊区家畜动物山羊BJ-MY-OT-S49株(GQ499948)、家犬BJ-TZ-OT-D57株(GQ499950)、牛BJ-TZ-OT-O30株(GQ499951)及BJ-TZ-OT-O31(GQ499952)、中部安徽地区山羊AH-GD-OT-S5株(GQ499933)；AH-GD-OT-23株(GQ499934)；AH-GD-OT-22株(GQ499935)、浙江发热病人Jin-2012株(KC485338)及Zhou-2012株(KC485340)及该地区牛ZJ-TT-OT～O21株(GQ499953)遗传关系密切，同源性99%。同时，泰国病人UT76株(EF551292)、UT169株(EF551297)、UT219株(EF551302)、UT302株(EF551304)、UT336株(551307)、UT395株(EF551309)、UT418株(EF551310)[11]、日本Kato型分离株(AY151986)及日本大林姬鼠SH205株(KC688302)及SH245株(KC688334)[12]也归为该基因簇。然而，本试验检出序列与安徽阜阳病人FY1株(GQ468797)及北京病人BJ-PG-2008株(GQ894502)[9]遗传关系较远(图2)，后者与日本新发Kawasaki型[12](AY191587)、南朝鲜Boryong株(AM494475)遗传关系密切。

图2 病原体 groEL基因进化分析

Fig.2 Phylogentic analysis based on theO.tsutsugamushigroELgene tested in the study

4 讨 论

恙虫病是严重威胁我国公共卫生的重要媒介传染病,尤其我国农业人群存在较高的暴露风险。随着全球气候变化，我国恙虫病流行疫区逐渐扩大到全国范围。本实验通过快速血清学及分子生物学诊断技术对临床诊断病例进行实验室明确诊断。并通过序列分析确定了感染病原体的血清型为Gilliam型，这一型别在我国多地病人、家畜动物、啮齿动物、恙螨、周边国家如泰国、日本、缅甸等国均有报道[1,4-5]。本病例是该院首例恙虫病报告病例，提示加强立克次体病诊断及鉴别诊断，尽可能降低多器官衰竭及病死率的发生，对当地发热病人的救治具有重要的临床意义。

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Laboratory investigation of the first scrub typhus case with multiorgan dysfunction in Hunnan Geriatric Hospital

ZHU Li-ming1,WANG Yong2,3，HUANG Jin1,DAI Ai-guo1,LUO Man1,HU Fang1,ZHANG Li-juan2

(1.DepartmentofGeriatricsRespiratoryMedicine,HunanGeriatricHospital410016,China;2.NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China；3.CollegeofAnimalScience&Technology,ShiheziUniversity,Shihezi832003,

To laboratory confirm of a clinical suspected scrub typhus with multiorgan failure in Hunnan Geriatrichospital and understand the molecular epidemiological characterizes of the pathogen tested in the study. Paired sera from the acute(24 days after onset of illness)and convalescence (32 days after illness)were tested for IgM and IgG antibodies againstOrientiatsutsugamushiby a gold conjugate-based rapid diagnostic test (RDT)and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),respectively. The loop-mediated isothermal amplification (LAMP) targeting the 56KD protein gene ofO.tsutsugamushiand the nested PCR targeting thegroELgene were performed respectively as the blood DNAs and the eschar DNA as temples. The IgM and IgG againstO.tsutsugamushifor sera from acute and convalescence stages were positive by RDT and the highest titer of IgM and IgGwere detected in 1∶2 560 for both of acute and convalescence stages sera. LAMP and nested PCR proved to be positive for theDNAs from acute stage blood and eschar tissue respectively.

scrub typhus;Orientiatsutsugamushi; multiorgan dysfunction; Laboratory investigation

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.019

“十二五”传染病重大专项课题(No.2012ZX10004215; No.2011ZX10004-001);国家基础研究项目(973计划)(No.2010CB530206)联合资助,朱黎明、王勇同等贡献

张丽娟， Email:zhanglijuan@icdc.cn

1.湖南老年医院,长沙 410016; 2.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所,北京 102206; 3.新疆石河子大学,石河子 832003

The work was supported by the National Key Science and Technology Projects of China (No.2012ZX10004215 and 2011ZX10004-001) and the National Basic Research Program of China (973 Program- 2010CB530206).

R376

B

1002-2694(2015)08-0775-03

2015-01-14；

2015-04-22