黄芪多糖、香菇多糖增强弓形虫wx2b4a表位疫苗免疫小鼠的保护作用

谢荣华，范久波，舒衡平

黄芪多糖、香菇多糖增强弓形虫wx2b4a表位疫苗免疫小鼠的保护作用

谢荣华1，范久波2，舒衡平3

目的 探讨黄芪多糖(Astragalan)、香菇多糖(Lentinan)增强弓形虫wx2b4a表位疫苗刺激机体产生免疫应答和保护免疫的效果。方法 将黄芪多糖、香菇多糖分别与弓形虫wx2b4a表位疫苗混合肌注免疫小鼠，ELISA法检测小鼠血清中IgG抗体水平，pcDNA3-W2b4a刺激下培养各组小鼠脾脏淋巴细胞，ELISA法检测IL-2、IFN-γ分泌水平，CCK-8法检测免疫鼠脾细胞增殖活性，并观察其受到弓形虫攻击感染后的生存时间。结果 各免疫组小鼠血清IgG抗体水平显著高于对照组(P<0.05)，且pcDNA3-W2b4a+黄芪多糖组要高于pcDNA3-W2b4a+香菇多糖组(P<0.05)；pcDNA3-W2b4a+黄芪多糖组、pcDNA3-W2b4a+香菇多糖组小鼠脾细胞IL-2、IFN-γ水平高于pcDNA3-W2b4a组(P<0.05)；各免疫组T细胞增殖活性与对照组比较明显增强(P<0.05)，且pcDNA3-W2b4a+香菇多糖组要高于pcDNA3-W2b4a+黄芪多糖组；小鼠攻击试验表明，pcDNA3-W2b4a+黄芪多糖组、pcDNA3-W2b4a+香菇多糖组小鼠存活时间明显长于对照组和pcDNA3-W2b4a组(P<0.05)。结论 黄芪多糖、香菇多糖可增强弓形虫wx2b4a表位疫苗产生免疫应答，并显示较好的免疫保护效应。

弓形虫；黄芪多糖；香菇多糖；表位疫苗；保护力

弓形虫寄生引起的感染非常普遍，估计全世界约有1/3 的人感染,多数感染者无症状或症状轻微。但严重免疫缺陷的病人，如艾滋病人等，发生感染，后果就很严重。孕妇感染可致胎儿畸形、流产及死胎等。目前尚无理想的药物及疫苗防治弓形虫病,研究弓形虫疫苗预防弓形虫病是目前研究的热点。本研究组在前期已构建了弓形虫新基因wx2b4a 表位疫苗质粒[1],能够诱导小鼠产生一定的抗弓形虫感染保护性免疫[2]，但效果也不理想,非常需要用免疫佐剂来增强弓形虫疫苗免疫原性,产生更有效和持久的保护性免疫，生物活性多糖是一类从植物、动物、微生物等生物体中提取的, 具有多种生物活性的碳水化合物。研究表明, 许多生物活性多糖具有免疫调节作用,且与其它免疫增强剂相比, 多糖具有毒副作用小、多效性、双向调节性及来源广等特点[3],成为当今研制新型免疫增强剂的发展方向之一。本研究探讨黄芪多糖、香菇多糖能否增强弓形虫wx2b4a表位疫苗刺激小鼠机体产生免疫应答和保护免疫的效果。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒 弓形虫RH株为本室传代保种、pcDNA3、pcDNA3-W2b4a为本室构建。

1.2 实验动物 6周龄昆明小鼠，雌雄各半，18～20 g，购自南华大学实验动物中心。

1.3 主要试剂与药物 HRP标记的羊抗小鼠IgG购自北京博大泰克公司；DMEM-H 基础培养基、青霉素链霉素和胎牛血清购自Gibco公司；IL-2、IFN-γ小鼠细胞因子检测ELISA试剂盒购自Excell公司；细胞增殖-毒性检测试剂盒(cck-8)购自上海美季生物技术有限公司；香菇多糖注射液(金陵药业股份有限公司福州梅峰制药厂，国药准字：H20030131)、注射用黄芪多糖(天津赛诺制药有限公司，国药准字：220040086)

1.4 实验动物分组及动物免疫 昆明小鼠115只，随机分为5组，雌雄各半，分别为Ⅰ组：pcDNA3-W2b4a质粒100 μg，Ⅱ组:pcDNA3-W2b4a质粒100 μg +黄芪多糖(50 mg/kg/d)，Ⅲ组：pcDNA3-W2b4a质粒100 μg+香菇多糖(2.5 mg/kg/d)，Ⅳ组:pcDNA3 100 μg, V组:生理盐水100 μL，将定量的黄芪多糖、香菇多糖分别与pcDNA3-W2b4a 质粒混合, 加PBS溶液至100 μL，从小鼠左后腿肌肉注射,每次100 μL,共免疫3次,每次间隔2周, 生理盐水组和pcDNA3组作对照。

1.5 ELISA 法测定小鼠血清IgG 分别于免疫前及末次免疫后第2、4 周, 断尾法取血，将每次所取血清样品做1∶100稀释，用间接ELISA法检测免疫小鼠IgG抗体水平。按试剂盒说明书操作。

1.6 小鼠脾细胞悬液制备 小鼠末次免疫后2周,在攻击实验前,每组小鼠随机处死8只，无菌取脾脏置于200目铜网,研磨后用1640培养液冲洗,收集脾细胞,破红细胞后,加入含有10%小牛血清的1640培养液吹打混匀,将脾细胞数调整至5×106/mL,用于细胞因子释放检测和脾细胞增殖实验。

1.7 细胞因子释放检测 加入含100 mL/L 胎牛血清和10 mL/L双抗的DMEM-H培养基将每组脾细胞数调整为1×105/mL，每组分别取双份100 μL加入24孔板中，加入10 μL pcDNA3-W2b4a质粒，在饱和湿度为50 mL/L CO2培养箱中37 ℃培养72 h后收集培养液上清，采用小鼠细胞因子ELISA检测试剂盒，严格按照说明书要求操作，检测IL-2、IFN-γ的水平。

1.8 免疫鼠脾细胞增殖实验(CCK-8法) 将各组脾细胞悬液100 μL (2×104/mL)分别加入96 孔细胞培养板(每组设2个复孔和对照孔),各组分别加入ConA(终浓度为10 μg/mL), 对照孔不加入ConA,37 ℃,5%CO2培养48 h。于培养结束前4 h 各孔加入10 μL CCK-8试剂。培养结束后,吸去100 μL上清,测定时每孔加入二甲亚砜(DMSO)100 μL,振荡溶解,用酶标仪测定吸光度(A450)

1.9 攻击感染实验 末次免疫后第4周，实验组和对照组小鼠经腹腔注射弓形虫RH株速殖子(500个/鼠)，观察记录小鼠的感染情况和死亡时间。

2 结 果

2.1 小鼠血清特异性IgG抗体水平 各免疫组小鼠特异性IgG抗体均高于对照组(P<0.05)，且均于末次免疫后第4周达到最高值；pcDNA3-W2b4a+黄芪多糖、pcDNA3-W2b4a+香菇多糖及pcDNA3-W2b4a组IgG抗体水平较对照组同期要高(P<0.05)，且末次免疫后第4周pcDNA3-W2b4a+黄芪多糖IgG抗体水平最高(A值为0.397±0.041)，而生理盐水组IgG抗体水平最低(A值为0.121±0.057)(图1)。

图1 ELISA 法检测小鼠血清IgG 的结果

2.2 细胞因子释放检测 以pcDNA3-W2b4a质粒刺激免疫小鼠脾细胞检测IL-2 、IFN-γ细胞因子的分泌(图2)。各免疫组小鼠脾细胞IL-2 、IFN-γ水平高于对照组(P<0.05)；pcDNA3-W2b4a+黄芪多糖组、pcDNA3-W2b4a+香菇多糖组小鼠脾细胞IL-2 、IFN-γ水平高于pcDNA3-W2b4a组(P<0.05)(图2)。

图2 ELISA 法检测小鼠脾细胞IL-2、IFN-γ 的结果

Fig.2 Detection of IL-2 and IFN-γ in splenoctes of mice by ELISA

2.3 免疫鼠脾细胞增殖实验(CCK-8法) 末次免疫后2周,ConA 刺激小鼠脾T细胞,免疫组小鼠脾细胞均发生增殖。各组脾细胞增殖活性如下(加ConA孔的A值与不加ConA孔的A值的比值):pcDNA3-W2b4a:1.23，pcDNA3-W2b4a+黄芪多糖组:1.98, pcDNA3-W2b4a+香菇多糖组：2.23,各免疫组脾淋巴细胞增殖能力与两对照组比较明显增强(P<0.05)。

2.4 抗攻击感染的免疫保护作用 末次免疫后第四周每只小鼠经腹腔注射500个弓形虫速殖子，实验小鼠均未能耐受弓形虫攻击感染。疫苗组小鼠存活时间明显长于pcDNA3组及生理盐水组(P<0.05),且pcDNA3-W2b4a+黄芪多糖组、pcDNA3-W2b4a+香菇多糖组小鼠存活时间长于pcDNA3-W2b4a组(P<0.05 )(表1)。

组 别Groups小鼠数量/只No.ofmice不同时间小鼠存活的数量/hNo.ofmiceindifferenttime/h144168192216240264288平均存活时间/hpcDNA3-W2b4a1515963110189±28*pcDNA3-W2b4a+黄芪多糖15151496411220±31*#pcDNA3-W2b4a+AstragalanpcDNA3-W2b4a+香菇多糖15151487411218±26*#pcDNA3-W2b4a+LentinanpcDNA315141420000164±11生理盐水1510000000151±7physiologicalsaline

注：*与对照组比较，P<0.05；#与pcDNA3-W2b4a比较，P<0.05。

Note: *As compared with the control group,P<0.05; # As compared with pcDNA3-W2b4a group,P<0.05.

3 讨 论

本课题选用黄芪多糖、香菇多糖作为弓形虫wx2b4a表位疫苗的佐剂，它们具有广泛的药理作用，也具有很强的免疫调节作用，可从多个方面发挥免疫调节作用：黄芪多糖可显著增强非特异性免疫和体液免疫功能,提高免疫抑制小鼠的IL-2、IFN-γ、TNF-a的水平，并可促进T淋巴细胞增殖[4]。代巧妹[5]等对急性弓形虫感染的BALB/c小鼠采用香菇多糖预处理之后能有效的调节Tregs的数量和功能，从而调控Th1/Th2之间的动态平衡达到治疗弓形虫的作用。

表位疫苗已在寄生虫疫苗的研究中获得可喜的免疫效果，本课题组前期成功构建了弓形虫多表位疫苗pcDNA3-W2b4a，并证实诱导小鼠产生一定的抗弓形虫感染的作用[2]。本研究结果显示：各免疫组小鼠血清IgG抗体水平显著高于对照组，且pcDNA3-W2b4a+黄芪多糖组高于pcDNA3-W2b4a+香菇多糖组，各免疫组抗体水平均在末次免疫后第4周最高；各免疫组T细胞增殖活性与对照组比较明显增强，且pcDNA3-W2b4a+香菇多糖组要大于pcDNA3-W2b4a+黄芪多糖组，这与王国秀[6]等研究认为协同ConA促进脾淋巴细胞增殖作用是香菇多糖大于黄芪多糖，促进脾淋巴细胞分泌IgG的是黄芪多糖大于香菇多糖的结果相一致。黄德尚[7]等研究黄芪多糖作为免疫佐剂能提高猪瘟疫苗对仔猪的免疫力,其作用机制与增加免疫球蛋白和促进猪瘟抗体形成有关。各免疫组小鼠脾细胞IL-2、IFN-γ水平高于对照组，pcDNA3-W2b4a+黄芪多糖组、pcDNA3-W2b4a+香菇多糖组小鼠脾细胞IL-2、IFN-γ水平高于pcDNA3-W2b4a组，提示黄芪多糖、香菇多糖结合wx2b4a表位疫苗倾向于Th1型优势的免疫应答。葛璞[8]等研究香菇多糖能够有效激发弓形虫RH株感染的BALB/c小鼠Th1型免疫应答的建立，对抗弓形虫感染。王庭欣[9]等研究黄芪多糖对正常小鼠的细胞免疫、体液免疫及巨噬细胞功能均有明显的增强作用。小鼠攻击试验表明，pcDNA3-W2b4a+黄芪多糖组、pcDNA3-W2b4a+香菇多糖组小鼠存活时间明显长于pcDNA3-W2b4a组和对照组。由此可见，黄芪多糖、香菇多糖可增强弓形虫wx2b4a表位疫苗免疫小鼠的保护作用，可望用于弓形虫亚单位疫苗的研制。

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DOI:10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.009

Shu Heng-ping, Email: hengpingshu@xysm.net

Enhancement of epitope vaccines fromwx2b4a

ofToxoplasmagondiipotency using Astragalan and Lentinan in mice

XIE Rong-hua1,FAN Jiu-bo2,SHU Heng-ping3

(1.EnvironmentBiologyofProfessionTechnologyCollegeinHunan,Hengyang421001,China;2.XiangfanCentralHospital,Xiangfan441021,China;3.DepartmentofParositology,XiangyaSchoolofMedicine,CentralSouthUniversity,Changsha410078,China)

We observed the effect of Astragalan and Lentinan to enhance the immune response and protective immunity induced by the epitope vaccines fromwx2b4a ofToxoplasmagondiiin mice. Mice were immunized intramuscularly with Astragalan and pcDNA3-W2b4a, Lentinan and pcDNA3-W2b4a, respectively. The level of IgG antibodies of mice were detected by ELISA.Invitro, the levels of IL-2 and IFN-γ that were secreted from pcDNA3-W2b4a-stimulated splenocytes were also measured by ELISA. Proliferation of T cells was detected by CCK-8 and mouse survival challenged byT.gondiiwas observed. Results showed that after the immunization, the level of IgG antibodies in immunized groups were significantly higher than those in the control group (P<0.05). The level of IgG antibodies in sera of mice inoculated with Astragalan and pcDNA3-W2b4a were higher than that in Lentinan and pcDNA3-W2b4a (P<0.05). After the immunization, the level of IL-2 and IFN-γ in splenoctes of mice inoculated with Astragalan and pcDNA3-W2b4a, Lentinan and pcDNA3-W2b4a were significantly higher than that those in GrouppcDNA3-W2b4a (allP<0.05). After the immunization, proliferation of T cells in immunized groups were significantly higher than those in the control group (P<0.05). The proliferation of T cells inoculated with Lentinan and pcDNA3-W2b4a were higher than Astragalan and pcDNA3-W2b4a (P<0.05). Following challenging with RH tachyzoites, the mean survival time in Astragalan and pcDNA3-W2b4a group, Lentinan and pcDNA3-W2b4a group were significantly longer than those in Group pcDNA3-W2b4a (allP<0.05). It indicated that Astragalan and Lentinan could enhancewx2b4a immune response that exerts a superior immune protection, which might be a new practical strategy for developingToxoplasmagondiivaccines. Keywords:Toxoplasmagondii; Astragalan; Lentinan; epitope vaccine; protective efficacy

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.008

舒衡平,Email: hengpingshu@xysm.net

1.湖南环境生物职业技术学院，衡阳 421001； 2.湖北襄阳中心医院，襄樊 441021； 3.中南大学湘雅医学院，长沙 410078

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R382

A

1002-2694(2015)08-0724-04

2015-01-28；

2015-04-16

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