γ-氨基丁酸在氯胺酮抗抑郁中的作用

刘向六，刘文学，邱丽丽，张广芬，周志强

0 引 言

全身麻醉药氯胺酮属于非选择性N-甲基-D-天(门)冬氨酸(N-methyl-d-aspartate，NMDA)受体拮抗剂。近年来大量临床及基础研究均表明氯胺酮具有快速、显著的抗抑郁作用，但具体作用机制仍不清楚［1－4］。既往研究表明氯胺酮可影响中枢兴奋/抑制平衡［4－6］，可能在其抗抑郁中发挥作用。本研究拟观察抑制性神经递质γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)在氯胺酮抗抑郁中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性Wistar 大鼠，32只，体重200 ～250 g，由南京军区南京总医院比较医学科提供，实验动物合格证号:0016668。在室温25 ℃、相对湿度为45%的动物房适应性饲养1 周，自由饮水，标准饮食。采用随机数字表法将大鼠均分为等渗盐水组、氯胺酮组、GABA 组及GABA+氯胺酮组，每组8 只。

1.2 侧脑室置管 所有大鼠均进行侧脑室置管(导管及给药系统购于深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。过程如下:麻醉后将大鼠固定于立体定位仪上，暴露前囟，坐标尺向后1.0 mm，旁开1.5 mm，自硬脑膜面向下3.5 mm。22 号导管置管，玻璃离子水门汀固定，单笼饲养1 周。给药时使用。

1.3 药物干预 术后第8 天行强迫游泳15 min 制备急性应激抑郁模型。造模后24 h，经26 号注射内管进行侧脑室给药，等渗盐水组及氯胺酮组给予等渗盐水2 μL，GABA 组及GABA+氯胺酮组给予GABA 50 μg(2 μL，美国Sigma 公司)，GABA 剂量选择依据文献［7］。侧脑室给药后10 min 等渗盐水组及GABA 组腹腔注射等渗盐水1 mL，氯胺酮组及GABA+氯胺酮组腹腔注射氯胺酮10 mg/kg(1 mL，福建古田制药厂)。

1.4 敞箱实验(open field test，OFT) 腹腔给药后30 min 应用OFT 进行大鼠自主活动评分，由2 名经过培训的实验人员根据评分标准进行盲法测评，取平均分。实验在1 个底面积为75 cm×75 cm、高40 cm 的敞箱内进行，底部均分为25 个方格。每只大鼠放在清洁敞箱的中央格，记录大鼠在5 min 内的各项得分。水平得分为大鼠水平穿越的方格数，大鼠3 或4 爪都进入1 个方格记为1 分;垂直得分为两前爪每离开底面1 次记为1 分。

1.5 强迫游泳实验(forced swimming test，FST)参考以往研究［8－9］，采用大鼠FST 建立急性应激抑郁模型，即将大鼠置于高65 cm、直径30 cm、盛有23 ℃～25 ℃自来水的清洁圆柱形玻璃缸中，水深40 cm，游泳15 min。OFT 后即刻将大鼠置入玻璃缸中行FST 6 min 进行测试，观察并记录后5 min 大鼠的不动时间。行为学测试由2 名经过培训的实验人员根据评分标准进行盲法测评，取平均值。

1.6 GABA 含量测定 行为学测试结束后，取大鼠大脑前额皮层，采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(试剂盒由南京建成生物工程研究所提供)测定GABA 水平。向预先包被了大鼠GABA 单克隆抗体的酶标孔中加入待测样品40 μL，37 ℃温育60 min，加生物素标记的抗GABA 抗体10 μL、链霉亲和素-HRP 50 μL，形成免疫复合物，再经过温育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入显色剂，37 ℃避光显色10 min，加终止液终止反应。在450 nm 处测光密度(A)值，通过绘制标准曲线求出标本中GABA 含量。

1.7 统计学分析 采用SPSS 16.0 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差()表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK 法。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 氯胺酮对FST 大鼠不动时间的影响 与氯胺酮组比较，等渗盐水组、GABA组、GABA+氯胺酮组不动时间增加(P ＜0.05)，与GABA组比较，GABA+氯胺酮组不动时间差异无统计学意义(P ＞0.05)。见表1。

2.2 氯胺酮对大鼠前额皮层GABA 含量的影响

与氯胺酮组比较，等渗盐水组、GABA 组、GABA+氯胺酮组大鼠前额皮层GABA 含量均升高(P ＜0.05)，与GABA 组比较，GABA+氯胺酮组大鼠前额皮层GABA 含量下降(P ＜0.05)。见表1。

表1 氯胺酮对FST 大鼠不动时间和前额皮层GABA 含量的影响Table 1 The effects of ketamine on the immobility time of FST and GABA level in prefrontal cortex in rats

表1 氯胺酮对FST 大鼠不动时间和前额皮层GABA 含量的影响Table 1 The effects of ketamine on the immobility time of FST and GABA level in prefrontal cortex in rats

与氯胺酮组比较，*P ＜0.05;与GABA 组比较，#P ＜0.05

组别 n 不动时间(s) 前额(n皮g层/mg G·A B pr Ao t含)量等渗盐水组 8 167.2±22.1* 23.3±6.3*氯胺酮组 8 107.5±21.2 12.4±3.4 GABA 组 8 159.8±17.5* 27.3±5.7*GABA+氯胺酮组 8 143.8±22.1* 18.0±5.4*#

2.3 氯胺酮对大鼠OFT 水平运动及垂直运动的影响 4 组大鼠水平运动OFT 得分差异无统计学意义(P ＞0.05)，垂直运动OFT 得分差异均无统计学意义(P ＞0.05)。见表2。

表2 氯胺酮对大鼠OFT 水平运动及垂直运动的影响，分)Table 2 The effects of ketamine on the crossing and the rearing scores of OFT in rats，score)

表2 氯胺酮对大鼠OFT 水平运动及垂直运动的影响，分)Table 2 The effects of ketamine on the crossing and the rearing scores of OFT in rats，score)

分组 n 水平运动O F T得分垂直运动等渗盐水组8 54.250±6.884 7.625±1.782氯胺酮组 8 50.750±7.842 6.375±1.475 GABA 组 8 52.375±7.421 7.625±1.908 GABA+氯胺酮组8 52.125±8.993 7.000±1.309

3 讨 论

抑郁症状为心境障碍的一种临床症状，抑郁症是以显著而持久的心境低落、思维迟缓、认知功能损害、意志活动减退和躯体症状为主要临床特征的一类心境障碍［10］。强迫游泳所致抑郁模型属于行为绝望模型，当大鼠被迫在局限的空间游泳，它们首先拼命地泳动试图逃跑，随后处于一种漂浮的不动状态，仅露出鼻孔维持呼吸，四肢偶尔划动以保持身体不至于沉下去，这种状态即不动状态，属于“行为绝望”。该模型具有简单、快速、敏感等特点，目前国内外关于探讨氯胺酮抗抑郁机制的研究绝大多数采用此模型，因此在本实验中也选用此模型。本研究结果显示，氯胺酮10 mg/kg 给药后30 min，大鼠FST 不动时间明显下降，再次证实了氯胺酮快速有效地抗抑郁作用。

GABA 是抑制性神经递质的主要类型，GABA 增多能够抑制兴奋性神经元，导致兴奋性神经递质谷氨酸合成减少，从而减弱突触再生相关信号，促进抑郁症发生［11－12］。我们前期研究发现氯胺酮在大鼠急性抑郁模型中产生确切的抗抑郁作用，同时伴随大鼠前额皮层GABA 下调，这提示氯胺酮的抗抑郁作用可能与GABA 下调有关［4］。本研究采用侧脑室给药预先补充GABA 含量，结果发现给予氯胺酮后并未减少大鼠FST 不动时间。氯胺酮给药后30 min 大鼠前额皮层GABA 含量显著下降，侧脑室补充GABA 后大鼠前额皮层GABA 含量增加，同时阻断了氯胺酮抗抑郁作用。虽然与GABA 组相比，GABA+氯胺酮组大鼠前额皮层GABA 含量显著下降，但两组之间FST 不动时间差异并无统计学意义，可能是侧脑室给药后大鼠脑组织GABA 基础含量较高从而导致氯胺酮未能发挥抗抑郁作用。根据以上结果并结合以往研究，推测氯胺酮可能通过抑制大鼠前额皮层GABA 生成，从而减弱对兴奋性神经元的抑制作用，导致谷氨酸水平升高，进一步激活突触再生相关信号，促进突触再生，从而产生抗抑郁作用。

另外本研究结果发现侧脑室单独给予GABA对大鼠不动时间无明显影响，且各组大鼠水平运动及垂直运动等运动能力评分无显著差异，实验过程中大鼠均未死亡，据此可排除实验操作及药物处理对大鼠自主活动的影响。

有关GABA 对突触后相关信号通路分子的影响及在氯胺酮抗抑郁中的作用尚需更多的研究来阐明，以期为研发快速有效的新型抗抑郁药提供理论参考。

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