Nrf2 基因敲除对小鼠蛛网膜下腔出血后小胶质细胞/巨噬细胞活化的影响

李 桃，王汉东，丁 宇，何 进，丁 可，陆新宇，徐建国，韦武亭

0 引 言

蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)在临床上高致死和高致残率，并且伴严重后遗症［1－3］。SAH 后继发性脑损伤的病理生理机制复杂，而脑内小胶质细胞/巨噬细胞(microglia/macrophage，M/M)在SAH 脑组织损伤和修复中具有重要作用。研究发现，M/M 在脑损伤后可发挥加重损伤或促进损伤修复的双重作用［4］。根据产生和分泌的炎症因子的不同，将活化的M/M 分为经典活化型和替代活化型［5－7］，经典活化型也称为M1 型，主要产生一系列促炎因子，如诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，INOS)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6 及细胞趋化因子，在诱导白细胞迁移并消灭外来病原微生物方面发挥重要作用;替代活化型也称为M2 型，主要产生如精氨酸酶1(arginase1，Arg1)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)和IL-10 等一系列抗炎因子，在吞噬坏死组织碎片和促进组织再生修复中发挥重要作用［4］。在实验性小鼠脑梗塞和脑外伤等脑损伤早期，活化的M/M 主要表现为M1 型［6－7］，产生各种促炎因子和活性氧族(reactive oxygen species，ROS)，加重继发性脑损伤。研究表明，炎症反应、炎症细胞活化和氧化应激在SAH 后继发性损伤中发挥了重要作用，而小胶质细胞活化可能是影响SAH 后继发性脑损伤的一个重要因素。核因子NF-E2 相关因子2(nuclear factor erythroid2 factor 2，Nrf2)为细胞内调控抗氧化酶和II相解毒酶的主要因子，活化后可减轻和抑制过激的氧化应激和炎症反应［8］。Nrf2 基因敲除小鼠在SAH 后炎症因子和氧化应激产物增加，加重继发性脑损伤［9］。此外，在小鼠阿尔茨海默病模型中，Nrf2 基因敲除促进了小胶质细胞M1 型极化产物的表达［10］。因此，Nrf2 可能为调节M/M 活化的重要因子。本研究应用小鼠SAH 模型来明确SAH 后M/M 活化，以及Nrf2 基因敲除对M/M 活化的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型的建立 健康雄性野生型ICR 小鼠(70 只)及Nrf2 基因敲除小鼠(35 只)均由我院比较医学科提供，体重30 ～35 g，实验动物合格证号:CXK(军)2007-012。动物饲养于清洁级环境，正常光照，自由饮水。环境温度25 ℃。将小鼠按随机数字表法分为野生型假手术组、野生型SAH 组、基因敲除假手术组和基因敲除SAH 组。小鼠采用自体血视交叉注射建立SAH 模型［9］。假手术组行同样抽血、钻孔及置针，但不行注血，术后放回鼠笼，置25 ℃空洞房间，自由饮食饮水。

1.2 主要试剂 DNA 提取试剂盒(GK0124，上海捷瑞生物工程有限公司)，羊抗小鼠Iba1 抗体(1∶500，abcom，美国)，β-actin 抗体(1∶3000，bioworld，美国)，羊抗兔HRP 二抗(1∶3000，bioworld，美国)，驴抗羊HRP 二抗(1∶100，北京中杉金桥生物技术有限公司)，驴抗兔荧光二抗(1∶500，Jackson，美国)，驴抗大鼠荧光二抗(1∶500，Jackson，美国)，组织裂解液、5X 上样缓冲液、PMSF 蛋白酶抑制剂、ECL 发光液、免疫染色封闭液、免疫染色抗体稀释液(碧云天生物技术研究所)，免疫组化SP 试剂盒和DAB 显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 标本准备 小鼠经水合氯醛400 mg/kg 腹腔注射麻醉，固定于木板上，经左心室灌注等渗盐水至肝苍白(约10 min)。标本经等渗盐水灌注后断头取脑，取双侧颞叶底面共约50 mg 脑组织立即置于液氮中待用，用Western blot 法检测。标本经等渗盐水灌注冲洗后，继续灌注20mL 中性甲醛溶液固定，取整个大脑置于中性甲醛中浸泡过夜，次日经0.01 mol/L PBS 洗涤后，冠状切取包含挫伤区脑组织并进行石蜡包埋，4 μm 厚切片，用于免疫组化检测。次日经0.01 mol/L PBS 洗涤后浸泡于含20%蔗糖的0.01 mol/L PBS 溶液中，带标本沉底，换为30%的蔗糖溶液浸泡至脑组织沉底，OCT 胶包埋后10 μm 冰冻切片，－80 ℃冻存备用，用于免疫荧光检测。假手术组于术后24 h 取标本，SAH 组于SAH 术后第1、3、5 天留取标本。

1.4 免疫组化染色检测 切片常规脱蜡水化，0.01 mol/L(pH 6.0)枸橼酸缓冲液抗原修复，3%H2O2室温20 min，免疫染色封闭液室温20 min，0.01 mol/L PBS 稀释的一抗2 h，PBS 漂洗，依据免疫组化试剂盒和DAB 显色试剂盒说明书步骤进行，最后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封固，显微镜观察。每组选取3 只鼠脑组织切片，每张切片随机选取5个视野(400 倍)拍照，采用Image pro plus 软件计算阳性染色的平均光密度值。

1.5 免疫荧光染色检测 切片复温，0.01 mol/L PBS 漂洗，BSA 封闭，一抗4 ℃过夜，PBS 漂洗，二抗室温2 h，PBS 漂洗，DAPI 染核2 min，PBS 漂洗，荧光抗淬灭剂封固，显微镜观察。每组选取3 只鼠脑组织切片，每张切片随机选取5 个视野(×400)拍照，采用Photoshop CS3 软件进行细胞计数。

1.6 Western blot 检测 从液氮中取出标本，脑组织经称重后置于研磨管，按比例加人预冷的组织裂解液后研磨，在冰上裂解0.5 h，将裂解物在标准离心机上以离心半径10 cm、12 000 r/min，4 ℃下离心10 min，收集上清，考马斯亮蓝法测定总蛋白含量。抽取部分上清液，按4∶1 加入上样缓冲液，并于100 ℃沸水中煮沸10 min。经聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、5%脱脂牛奶封闭、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、洗膜及普通ECL 化学发光法化学检测等处置后，胶片扫描保存并用ImageJ 2.0 软件进行分析。

1.7 统计学分析 采用SPSS 19.0 软件进行统计分析，实验数据采用均数±标准差)表示，多组间比较采用单因素方差分析和Bonferroni 法，方差不齐时采用近似F 检验Welch 法进行比较。以P≤0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠SAH 建模基本情况 SAH 建模后血液主要沉积在前颅底和双侧颞叶底面。与假手术小鼠相比，SAH 后小鼠大脑底面颞叶有较多血液沉积。小鼠在麻醉和注血过程中出现的死亡不计入死亡率，假手术组无小鼠死亡，SAH 造模后24 h 内野生型小鼠，基因敲除小鼠各死亡5 只。

2.2 野生型SAH 组M/M 活化情况

2.2.1 Western blot 检测 SAH 术后第1、3、5 天野生型假手术组和野生型SAH 组小鼠Iba1 蛋白表达量均较假手术组明显增高(P ＜0.05)，但第3 天与第5 天蛋白表达差异无统计学意义(P ＞0.05)。见图1，表1。

2.2.2 免疫组织化学检测 野生型假手术组Iba1免疫染色可见M/M 分布稀疏，胞体较小，细胞突触多而细。SAH 后可见颞叶皮层下M/M 数量明显增加，体积增大，分布密集，突起变粗等改变。经平均光密度值分析，SAH 后第1、3、5 天Iba1 蛋白表达量较假手术组明显增高(P ＜0.05)，但第3 天与第5天Iba1 蛋白表达量差异无统计学意义(P ＞0.05)。见图2，表1。

图1 Western blot 法检测野生型小鼠SAH 后Iba1 蛋白表达Figure 1 Iba1 expression by western blot after SAH in wild-type mice

图2 显微镜下观察野生型小鼠SAH 后Iba1 蛋白表达(IHC ×400)Figure 2 Iba1 expression by immunohistochemistry after SAH in wild-type mice(IHC ×400)

表1 野生型小鼠SAH 后Iba1 蛋白表达Table 1 Iba1 expression after SAH in wild-type mice

表1 野生型小鼠SAH 后Iba1 蛋白表达Table 1 Iba1 expression after SAH in wild-type mice

与假手术组比较，*P ＜0.05

分组 n 灰度值Ib比a1 蛋白平表均达光密度值野生型假手术组5 0.491±0.039 0.412±0.122野生术术术型后后后第第第SA 135 H天天天 组 555 000...699 532 706±±±000...000 644 966***000...699 267 538±±±000...122 312 534***

2.3 Nrf2 基因敲除促进M/M 活化和M1 极化

2.3.1 Western blot 检测Iba1 蛋白表达 SAH 后第3 天，野生型和基因敲除SAH 组较对应假手术组Iba1 蛋白表达明显增加(P ＜0.05)，基因敲除SAH组较野生型SAH 组Iba1 蛋白表达增加明显(P ＜0.05)。见图3，表2。

2.3.2 免疫荧光检测 野生型和基因敲除假手术组可见少量Iba1 染色的细胞，胞体较小，细胞突触多而细。SAH 后第3 天，颞叶皮层下Iba1+染色细胞数量明显增加，体积增大，而且基因敲除SAH 组较野生型SAH 组增加明显。野生型和基因敲除假手术组几乎未发现CD16/32+Iba1+染色细胞，SAH后第3 天CD16/32+Iba1+染色细胞明显增加，且基因敲除SAH 组较野生型SAH 组增加明显。SAH 后第3 天基因敲除组CD16/32+Iba1+细胞计数较野生型组增加明显(P ＜0.05)。见图4，表2。

图3 Western blot 检测小鼠SAH 后Iba1 蛋白表达Figure 3 Iba1 expression by Western blot after SAH between two types of mice

图4 小鼠SAH 后第3 天CD16/32+Iba1+细胞表达(IF ×400)Figure 4 CD16/32+Iba1+expression 3 d after SAH between two types of mice(IF ×400)

表2 小鼠SAH 后Iba1 蛋白表达和CD16/32+Iba1+细胞计数Table 2 Iba1 expression and CD16/32+Iba1+cell number after SAH between two types of mice

表2 小鼠SAH 后Iba1 蛋白表达和CD16/32+Iba1+细胞计数Table 2 Iba1 expression and CD16/32+Iba1+cell number after SAH between two types of mice

与对应假手术组比较，*P ＜0.05;与野生型SAH 组比较，#P ＜0.05

组别 n Iba1 蛋白表达 CD16/32+Iba1+细胞数(个/HP)野生型假手术组组5 1.157±0.080 0基因敲除假手术组 5 1.162±0.073 0野生型SAH 组 5 1.580±0.171* 30.200±6.300*基因敲除SAH 组 5 1.913±0.220*# 42.800±6.260*#

3 讨 论

研究表明，SAH 后炎性细胞活化、氧化应激及炎性反应在继发性脑损伤和进行性神经功能障碍中发挥着重要作用［2］。

脑损伤后脑内固有小胶质细胞被迅速活化，产生炎症因子、趋化因子和活性氧自由基等，并诱导血液中游离的炎症细胞迁移入损伤的脑组织，进一步加重炎症反应和氧化应激，加重继发性损伤。脑内小胶质细胞被认为与外周巨噬细胞同源，因此叫做M/M［4］。正常生理条件下M/M 活化较少，主要是免疫监视作用;在脑外伤、脑出血及脑梗死等疾病情况下，小胶质细胞的数量可迅速增加和活化，产生“呼吸爆发”反应，释放出大量的氧自由基和炎症因子，并在疾病的进展中发挥重要作用［10］。小胶质细胞活化后既可产生炎症因子又可产生抗炎和营养因子。在实验性小鼠脑梗塞和脑外伤等脑损伤后，早期活化的M/M 主要为M1 型，产生各种促炎因子［6－7］。因此，在脑损伤后早期，活化并呈M1 型极化状态的M/M 可能是加重继发性脑损伤的重要因素。而且在Hanafy 的实验中，用氯膦酸盐去除M/M能够明显减少小鼠SAH 后海马神经元凋亡［13］，说明M/M 在SAH 后继发性脑损伤中发挥了重要作用。本研究表明小鼠SAH 后M/M 标志物Iba1 蛋白表达增加，Iba1 免疫组化阳性细胞数量增加且体积增大，表明M/M 在SAH 后被诱导活化。免疫荧光染色发现，SAH 后第3 天大部分活化的M/M 可表达M1 极化标志物CD16/32。因此，小鼠SAH 后M/M可被诱导活化和M1 型极化。

Nrf2 为细胞内核转录因子，当被氧化应激源刺激后转移入核，结合到抗氧化反应原件并启动一系列抗氧化酶和解毒酶的表达［8］。研究表明，增加Nrf2 的活化可抑制过激的氧化应激和炎症反应，减轻小鼠脑外伤、脑出血及脑梗死引起的继发性损伤［12－14］，而Nrf2 基因敲除小鼠在脑外伤、脑出血和脑梗塞后表现为继发性损伤加重［11－15］。我们前期的研究发现，Nrf2 基因敲除促进脑外伤后氧化应激和炎症反应，促进小胶质细胞的活化，加重神经细胞凋亡和神经功能障碍［16］，而且，细胞内氧化还原状态能够调控巨噬细胞M1 型与M2 型的极化状态［17］。因此，我们认为Nrf2 对脑损伤后M/M 的活化和极化有重要调控作用。本实验的结果发现，Nrf2 基因敲除促进了SAH 后Iba1 蛋白表达增加，说明Nrf2基因敲除促进了M/M 的活化;而且，免疫荧光染色发现Nrf2 基因敲除促进SAH 后CD16/32+Iba1+细胞的增加，无Nrf2 的作用，M/M 在SAH 后M1 型极化增加。因此，Nrf2 基因敲除促进了小鼠SAH 后M/M 活化和M1 极化，这与我们的前期研究中Nrf2 基因敲除加重小鼠SAH 脑损伤相符合［9］。

综上所述，SAH 后M/M 被诱导活化和M1 极化，Nrf2 基因敲除加重了SAH 后小胶质细胞/巨噬细胞的活化和M1 极化。Nrf2 对SAH 后M/M 活化及极化具有重要调控作用。

［1］ Sehba FA，Hou J，Pluta RM，et al.The importance of early brain injury after subarachnoid hemorrhage［J］.Prog Neurobiol，2012，97(1):14-37.

［2］ Hasegawa Y，Suzuki H，Sozen T，et al.Apoptotic mechanisms for neuronal cells in early brain injury after subarachnoid hemorrhage［J］.Acta Neurochir Suppl，2011，110(Pt 1):43-48.

［3］ 李劲松，王汉东，杭春华，等.前循环高级别破裂动脉瘤急诊开颅术中脑肿胀的对策［J］.医学研究生学报，2013，26(11):1165-1167.

［4］ Sierra A，Abiega O，Shahraz A，et al.Janus-faced microglia:beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis［J］.Front Cell Neurosci，2013，7:6.

［5］ Liu C，Li Y，Yu J，et al.Targeting the shift from M1 to M2 macrophages in experimental autoimmune encephalomyelitis mice treated with fasudil［J］.PLoS One，2013，8(2):e54841.

［6］ Wang G，Zhang J，Hu X，et al.Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2013，33(12):1864-1874.

［7］ Hu X，Li P，Guo Y，et al.Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia［J］.Stroke，2012，43(11):3063-3070.

［8］ Itoh K，Chiba T，Takahashi S，et al.An Nrf2/Small Maf Heterodimer Mediates the Induction of Phase II Detoxifying Enzyme Genes through Antioxidant Response Elements［J］.Bioche Biophy Res Commu，1997，236(2):313-322.

［9］ 李 桃，王汉东，丁 宇，等.Nrf2 基因敲除对小鼠蛛网膜下腔出血后脑损伤的作用［J］.医学研究生学报，2014，27(11):1128-1132.

［10］ Rojo AI，Innamorato NG，Martin-Moreno AM，et al.Nrf2 regulates microglial dynamics and neuroinflammation in experimental Parkinson's disease［J］.Glia，2010，58(5):588-598.

［11］ Hanafy KA.The role of microglia and the TLR4 pathway in neuronal apoptosis and vasospasm after subarachnoid hemorrhage［J］.J Neuroinflammation，2013，10:83.

［12］ Wang J，Fields J，Zhao C，et al.Role of Nrf2 in protection against intracerebral hemorrhage injury in mice［J］.Free Radic Biol Med，2007，43(3):408-414.

［13］ Jin W，Kong J，Wang H，et al.Protective effect of tert-butylhydroquinone on cerebral inflammatory response following traumatic brain injury in mice［J］.Injury，2011，42(7):714-718.

［14］ Hong Y，Yan W，Chen S，et al.The role of Nrf2 signaling in the regulation of antioxidants and detoxifying enzymes after traumatic brain injury in rats and mice［J］.Acta Pharmacol Sin，2010，31(11):1421-1430.

［15］ Innamorato NG，Rojo AI，García-Yagüe AJ，et al.The transcription factor Nrf2 is a therapeutic target against brain inflammation［J］.J Immunol，2008，181(1):680-689.

［16］ Jin W，Wang H，Yan W，et al.Role of Nrf2 in protection against traumatic brain injury in mice［J］.J Neurotrauma，2009，26(1):131-139.

［17］ Brune B，Dehne N，Grossmann N，et al.Redox control of inflammation in macrophages［J］.Antioxid Redox Signal，2013，19(6):595-637.