超声监测非酒精性脂肪肝兔模型的建立

张容亮，韦 嘉，陆永萍，袁 媛，汤跃跃，李云燕

0 引 言

非酒精性脂肪肝病发病率近几年在中国和欧美迅速上升，成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病［1－5］。调控动物模型的食物构成及摄入是研究相关脂肪肝发病的最好方法，高脂饮食可影响肝脂肪代谢，使肝三酰甘油合成及输出增多，更快建立兔脂肪肝模型。本研究首先对兔进行高脂喂养，建立与人类脂肪性肝病发生发展相似的脂肪肝动物模型，用二维超声及病理切片观察兔脂肪肝纤维化情况，为深入研究肝纤维化发病机制及病理提供实验模型。脂肪肝是以肝细胞弥漫性脂肪变性为主的临床病理综合征。由于脂肪肝具有固定的超声图像特征，大多数学者肯定了超声检查作为脂肪肝首选的影像学诊断手段，且简便、无创、好操作，能实时动态追踪监测兔肝回声，动态存储图片以便分析［3－6］。

1 材料与方法

1.1 动物模型的制备 健康雄性日本大耳白兔40只，体重1.00 ～1.52 kg，按随机数字表法分为对照组和实验组，每组20 只，实验动物许可证号:SCXK(滇)2011-0004，由昆明医科大学实验动物科提供，实验组给予高脂喂养(配方为:胆固醇2%，牛油10%，白糖5%，蛋黄粉8%，基础饲料75%)，自由饮水，通风，12 h 光照［7］。对照组:给予普通饲料喂养，自由饮水，通风，12 h 光照。

1.2 超声观察兔肝 采用Aixplorer 型ShearWaveTM实时剪切波超声成像诊断仪(法国Supersonic Imagine公司)，L15-4 探头。模型制备过程中喂养12、16 和20 周，每次超声观察前兔禁食8 ～12 h，将兔平躺固定于操作台上(无需麻醉)，备皮，充分暴露检查区，共对兔肝进行4 次超声观察，包括肝大小、回声、包膜情况，有无腹水等，对肝声像图征象进行详细记录。超声评价脂肪肝程度，轻度:肝体积稍增大，光点细密、回声轻度增强，肝内管状结构可见;中度:肝体积增大，光点细密、回声增强，远场回声衰减，管状结构模糊;重度:肝体积增大，光点细密、回声显著增强，远场回声显著衰减，管状结构显示不清［8－9］。

1.3 病理观察 20 周超声观察后处死动物，观察肝大小、形态、颜色、表面光滑度、叶间裂宽度、边缘锐利度及切面情况。10%甲醛固定肝组织标本，经常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(片厚4 ～6 μm)，分别进行HE及苦味酸(天狼星红:10%的中性甲醛溶液、硝基染料类)染色。根据脂肪肝的病变程度分为5 度(F0-4)，F0:正常肝，脂肪变面积＜5%;F1:轻微脂肪变性，脂肪变面积10%～30%;F2:轻度脂肪肝，脂肪变面积31%～50%;F3:中度脂肪肝，脂肪变面积51%～75%;F4:重度脂肪肝，＞75%肝细胞脂肪变性。根据胶原纤维沉积部位、范围、对肝结构破坏程度和对肝微循环的影响的大小，将肝纤维化分为4 期;S1:汇管区和汇管区周围纤维化及局限窦周纤维化或小叶内小纤维瘢痕，以上纤维化形式范围小，不足以影响小叶结构的完整性或微循环;S2:小叶内有纤维间隔形成，可见多条纤维间隔，但小叶结构大致保留;S3:大量纤维间隔，分隔并破坏肝小叶，致小叶结构紊乱，但尚无肝硬化。S4:纤维间隔包绕于假小叶周围，间隔内胶原及弹力纤维经改建，多环绕假小叶成平行排列［9－10］。

1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0 软件进行统计分析，所有计量资料以均数±标准差)表示，组间比较采用t 检验，兔龄与体重的关系采用Pearson线性相关分析。以P≤0.05 为有统计学意义。

2 结 果

动物模型在制备饲养过程中，对照组死亡2 只，于第12 及16 周死亡，死亡原因为不适应环境;实验组因于第12 周死亡1 只，原因可能为对高脂肪饲料不耐受，腹泻致死。

2.1 一般情况 对照组:兔皮毛光滑，活动灵活，进食量与排便正常，体重稳步逐增。实验组:兔皮毛光滑，活动稍迟缓，进食量大，排便正常，体重增长快。喂养12、16、20 周实验组体重均高于对照组，差异有统计学意义(P ＜0.05)。2 组兔龄与体重均呈正相关(r=0.96，P ＜0.01)。见表1。

2.2 兔肝超声观察 对照组:全部监测过程中，兔肝二维超声表现呈中等稍低回声，内部回声均匀，光点稍粗，管道结构清晰，管壁与实质对比回声稍强，包膜规则、光滑，无腹水。实验组:喂养0 周，兔肝超声表现同对照组;喂养12 周后均发生了脂肪肝改变，且随着喂饲期的增加，脂肪肝的超声表现逐渐加重。12周时，8 例表现为轻度脂肪肝声像，与对照组对比，兔肝光点稍显细密，回声稍增强，肝体积略增大;9 例为中度脂肪肝，兔肝光点细密，回声增强，肝体积增大较轻度组明显;2 例为重度，光点细密，回声增强，肝体积增大更明显，肝内管道系统结构模糊;16 周时，5 例轻度脂肪肝发展为中度，2 例中度脂肪肝发展为重度;20 周时，3 例轻度脂肪肝全部发展为中度脂肪肝，5 例中度脂肪肝发展为重度脂肪肝。16 周及20 周时均有3 例重度脂肪肝兔发生了腹水声像(肝肾间隙可见暗区1 ～3 cm)，进入了肝硬化期。见图1。喂养20周后，对全部37 例兔肝均进行超声观察后，取出兔肝，观察兔肝标本，制备病理切片。对照组:肝被膜光滑，大小适中，肝外观呈暗红色，左叶明显大于右叶，叶间裂清晰，边缘锐，切面光滑;如触口唇，弹性好，质软细腻。实验组:肝均匀肿大，肝叶饱满，右叶增大，肝左右叶比例减小，叶间裂变小，肝边缘变钝，颜色为灰红色，质地韧，如触鼻尖，有油腻感。

表1 不同时间生长状况兔龄肝超声表现比较Table 1 Comparison of rabbit's weight(kg)in two groups and the grade of fatty liver in sonogram

图1 兔肝超声图像Figure 1 The sonographic image of liver in two groups

2.3 HE 染色病理切片观察脂肪变的情况 对照组:以小叶中央静脉为中心呈放射状排列，肝小叶轮廓清晰，肝细胞呈多边形，细胞分界清，核圆，位于细胞中央，细胞质丰富，呈嗜碱性。脂肪变面积＜5%。以F0 期为主。实验组:肝细胞排列紊乱不齐，肝细胞浊肿，部分肝细胞细胞质中可见大小不等圆形脂滴空泡肝细胞，脂肪变性广泛分布，有炎性细胞浸润。脂肪变面积35%～85%。脂肪变程度以中重度(F3－F4)为主。见图2，表2。

图2 镜下观察兔肝病理图片(HE ×200)Figure 2 The pathological result of livers in two groups(HE staining ×200)

2.4 苦味酸-天狼星红染色病理切片分析纤维化程度 对所有兔肝进行苦味酸染色，对照组:未见明显的纤维化，均为S0 期;实验组:出现不同程度的纤维化表现，以中重度纤维化为主(S2 期以上)。见图3，表3。

表2 兔肝HE 染色脂肪变分期比较(n)Table 2 The pathological staging of steatosis(HE staining)in two groups(n)

图3 镜下观察兔肝纤维化程度(苦味酸染色 ×200)Figure 3 The pathological result of livers in two groups(Picric-Sirius Red staining ×200)

表3 实验兔20 周肝超声与病理分期对照(n)Table 3 Comparison of ultrasonography and pathological staging(n)

3 讨 论

随着对脂肪肝机制的深入认识，动物模型的建立也成为了关键，制备完善、标准的动物模型是研究疾病的基础，通过高脂饲养建立的兔肝纤维化模型与人类日常饮食所致的肝脂肪代谢相似，是较理想的肝纤维化兔模型［8－12］。

本实验选用日本大耳兔造模，是因为兔的饮食结构利用造模，兔肝体积更便于超声观察。本研究给予兔高脂饮食后，发现兔脂肪肝在12 周后陆续形成，至16 ～20 周后基本全部形成了中重度脂肪肝，最终经过病理也证实了脂肪肝兔模型成功建立。高脂饮食的造模方法脂肪摄入量易控制，影响因素少，可控性强，重复性好，成功率高。

我们利用超声对2 组兔肝进行持续监测，在完全相同的检查条件下，对同一兔不同喂养时期的肝进行观察。对照组不同时期(4 次)肝超声表现基本相同;而实验组12 周时便有脂肪肝的发生，随着喂养周期的增长，脂肪肝的程度逐渐加重，进入16 ～20周时以重度脂肪肝为主，并有部分发生了肝硬化腹水。超声可动态观察此过程，并且明确本方法造模的可行性。20 周时，经过超声观察后，对兔肝进行病理观察，病理与超声表现呈一致趋势。此结果即显示了脂肪肝分度的病理特征，同时也证实了超声观察的可靠性。

高脂所致的脂肪变多以大泡性为主的混合性脂肪变，大泡性肝脂肪变多呈良性过程，去除病因可逆转，小泡性脂肪肝变则预后不良，不经治疗两者均可引起坏死性炎症及肝纤维化。此次造模过程中，有2 例在12 周时呈现重度脂肪肝声像的兔肝20 周末的肝纤维化分期均为S4 期，并有肝硬化腹水的表现，这与脂肪肝程度越重、时间越久、肝纤维化就越重的病理原理相一致。本研究模拟目前人类不良饮食方式，采用喂饲高脂方法建立脂肪肝动物模型，探讨脂肪肝的病变特点和病理学量化诊断指标。一般认为，脂肪肝的发展是从单纯性脂肪肝到脂肪性肝炎，最终进展为脂肪性肝硬化［10－12］。

本研究病理观察显示:所有经高脂饮食喂养的兔模型，均形成了脂肪肝，并且进入了纤维化期，与超声的观察结果一致，提示在建模过程中，超声是一种可靠、可实施动态观察的手段。超声检查对本模型建立提供了一个值得探讨的观测指标，简便、无创、操作便利，无需麻醉动物，能实时动态追踪监测，且能动态存储图片以便分析。但本实验局限性在于例数尚不够，还需进一步扩大标本量加以研究;此外，我们选用兔制备动物模型，兔为食草动物，常规饮食不同于人类，其消化代谢与人类有一定的差异，尚不能完全替代人脂肪肝的形成演变［13－16］。

［1］ 中华医学会内分泌分会肝病与代谢学组.中华医学会内分泌学分会“非酒精性脂肪性肝病与相关代谢紊乱诊疗共识”［J］.中华内分泌代谢杂志，2010，26(7):531-534.

［2］ Finelli C，Tarantino G.What is the role of adiponectin in obesity related non-alcoholic fatty liver disease?［J］World J Gastroenterol，2013，19(6):802-812.

［3］ 范建高，沈 峰.2012 脂肪性肝病诊疗进展［J］.中华肝脏病杂志，2013，21(3):170-172.

［4］ 刘滨菘，李 强.脂肪及细胞因子与非酒精性脂肪肝病关系的研究进展［J］.医学研究生学报，2013，26(11):1211-1214.

［5］ 王 宇，郑锦锋.非酒精性脂肪肝营养干预的研究进展［J］.医学研究生学报，2014，27(1):99-101.

［6］ Xu ZJ，Fan JG，Ding XD，et al.Characterization of high-fat，diet-induced，non-alcoholic steatohepatitis with fibrosis in rats［J］.Dig Dis Sci，2010，55(4):931-940.

［7］ Hebbard L，George J.Animal models of nonalcoholic fatty liver disease［J］.Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2011，8(1):35-44.

［8］ Chalasani N，Younossi Z，Lavine JE，et al.The diagnosis and management of non-alcoholic fatty liver disease:practice guideline by the American Gastroenterological Association，American Association for the Study of Liver Diseases，and American College of Gastroenterology［J］.Gastroenterology，2012，142(7):1592-1609.

［9］ 中华医学会肝脏病分会脂肪肝和酒精性性肝病学组.非酒精性脂肪性肝病诊疗指南［J］.中华医学信息导报，2010，25(12):18-20.

［10］ 苏 兰，高 萍.Chemerin 在肥胖和2 型糖尿病中的作用机制［J］.医学研究生学报，2013，26(6):646-649.

［11］ Fan JG，Farrell GC.Epidemiology of non-alcoholic fatty liver disease in China［J］.Hepatology，2009，50(1):204-210.

［12］ Thoma C，Day CP，Trenell MI.Lifestyle interventions for the treatment of non-alcoholic fatty liver disease in adults:a systematic review［J］.Hepatology，2012，56(1):255-266.

［13］ Cheah WL，Lee PY，Chang CT，et al.Prevalence of ultrasound diagnosed nonalcoholic fatty liver disease among rural indigenous community of Sarawak and its association with biochemical and anthropometric measures［J］.Southeast Asian J Trop Med Public Health，2013，44(2):309-317.

［14］ 黄盛玉.超声检查在脂肪肝诊断中的临床意义［J］.中国现代医生，2012，50(31):155-156.

［15］ McCarthy EM，Rinella ME.The role of diet and nutrient composition in nonalcoholic Fatty liver disease［J］.Acad Nutr Diet，2012，112(3):401-409.

［16］ 翁小刚，朱晓新，杨 庆，等.非酒精性脂肪肝的实验研究进展［J］.中国实验方剂学杂志，2009，15(11):104-109.