RNA 干扰Cofilin-1 基因沉默对人肝癌细胞株Huh-7侵袭和转移能力的影响

曹建平，龙晓兰，龚 勇，李晓杰，谢海龙

0 引 言

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是严重威胁人类生命的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在各种类型恶性肿瘤中更是位居前列，超过50%的新发病例发生在中国［1－2］。HCC 早期并无特征表现，早期发现难，一旦出现症状大部分已发生转移［3］。虽然综合治疗HCC 的措施不断改善，但HCC 患者预后仍然很差［4］。因此深入研究HCC 的发病机理，探讨HCC 的早期转移及其高侵袭生长的分子病理机制，发现病理过程中的重要环节和关键分子，寻找具有HCC 治疗价值的药物靶点，将对HCC 的肿瘤生物学研究、药物研发及临床治疗奠定基础。

Cofilin-1 基因定位于11q13，其编码的蛋白质分子量为19 kDa，是一种细胞骨架蛋白，属于肌动蛋白解聚因子家族。Cofilin-1 在促进肌动蛋白解聚/聚合和肌动蛋白丝的快速周转中发挥重要作用［5］。肌动蛋白细胞骨架的重组参与肿瘤进展、细胞运动、细胞粘着、细胞侵袭和血管生成。在癌细胞中抑制Cofilin-1 活性能使细胞运动能力下降［6］。下调Cofilin-1 蛋白表达的降低了侵袭伪足组装及其稳定性，表明Cofilin-1 在细胞侵袭过程中起至关重要的作用［7］。Cofilin-1 在多种肿瘤中存在高表达，参与这些肿瘤的发病过程［8－9］。但该基因在HCC 中表达国内外文献报道少，本研究拟通过实时荧光定量PCR 技术检测Cofilin-1 在HCC 组织中的表达，并通过基因沉默技术观察Cofilin-1 基因表达下调后对人肝癌细胞株Huh-7 迁移和侵袭的影响，探讨Cofilin-1在HCC 发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞和组织标本 细胞:Huh-7 细胞是人肝癌细胞，原购自美国模式培养集存库，由本实验室保存。细胞均用含10%胎牛血清的DMEM 培养基培养。组织:收集郴州市第一人民医院病理科2009 年1 月至2013 年2 月肝癌标本30 例，所有患者术前均未接受放化疗处理，均经病理证实为肝细胞癌。30 例肝癌中伴有肝硬化18 例。根据Edmondson 肝癌分级标准进行组织学分级，其中Ⅰ级5 例，Ⅱ级12 例，Ⅲ级13 例。年龄为17 ～71 岁，平均年龄(56.8±2.0)岁，其中男21 例，女9 例。取癌和癌旁＜1 cm 范围内正常组织，冻存于－80 ℃。

1.2 主要试剂 DMEM、胎牛血清、DMSO 均购自Gibco 公司;细胞培养皿、Tip 头、冻存管、孔板购自Corning 公司;细胞裂解液，Trizol 试剂，购自Invitrogen公司;BCA 蛋白分析试剂盒(BCA protein Kit)购自Pierce 公司;实时荧光定量PCR 试剂盒均购自TaKa-Ra 公司;DEPC 水购自Invitrogen 公司;HRP 标记的羊抗鼠IgG(H+L)抗体和HRP 标记的羊抗兔IgG 抗体购自上海康城公司;Cofilin-1 抗体购自Santa Cruz;所有引物均由上海Invitrogen 公司合成;siRNA序列由上海吉玛公司合成;Transwell 小室(pore size:8.0 μm)及Matrigel 均购自BD Bioscience 公司。

1.3 实时荧光定量PCR 检测Cofilin-1 在肝癌组织中的表达

1.3.1 组织总RNA的提取 将组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，液氮挥发完后再加入少量液氮，如此反复研磨至组织块成细粉末状，转入离心管中，加入Trizol(50 ～100 mg/mL Trizol)，然后用带7 号针头的5 mL 注射器抽吸8 ～10 次，再转入新的EP 管中，充分吹打至不黏稠后移至去除RNA 酶的1.5 mL EP 管中;加入0.2 mL/管新开封的氯仿，剧烈振荡15 s，室温孵育5 min，4 ℃，12000×g，离心15 min;将上清移至新的1.5 mL EP 管中，加入0.5 mL/管的异丙醇，－20 ℃孵育20 min，4 ℃，12 000×g 离心10 min;去除上清，75%乙醇1 mL/管洗涤，4 ℃，7500×g 离心5 min;室温干燥10 ～20 min，用DEPC 处理后的无RNA 酶H2O 溶解沉淀，分光光度计定量RNA。

1.3.2 引物的设计与合成 引物由上海Invitrogen设计及合成。Cofilin-1 基因引物序列上游:5'-GACTGCCGCTATGCCCTCTATG，下 游:5'-CTTCTTCTTGATGGCGTCCTTG;看家基因β-actin 引物序列上游:5' TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA，下游:5'-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG。

1.3.3 实时荧光定量RT-PCR与相对定量分析在冰上制备反应液:5×PrimerScriptTMBuffer 2.0 μL、Random 6 mers(100 μmol/L)0.5 μL、Primer ScriptTMRT Enzyme Mix 0.5 μL、Oligo dT Primer(50 μmol/L)0.5 μL，加入模板RNA 1 μL(500 ng/μL)，补Rnase Free H2O 至10 μL，37 ℃培养15 min，85 ℃5 s 使反转录酶灭活。Real-Time PCR 所用SYBR Premix EX TaqTM 购自TaKaRa 公司。10 μL 反应体系:SYBR Premix Ex Taq(2×)5 μL，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.4 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μL，ROX Reference Dye(50×)0.2 μL，模板1 μL，dH2O 3 μL。反应条件:95 ℃30 s;95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 个循环;95 ℃15 s，60 ℃30 s，95 ℃15 s。使用ABI PRISM 7900HT 仪器。相对定量采用比较CT(Cycle threshold)法。计算公式:

1.4 细胞转染 由上海吉玛公司合成cofilin-1 siRNA 序列。cofilin-1-RNA 序列:正义链为:5'-GGUGUCAUCAAGGUGUUCATT-3';反义链为:5'-UGAACACCUUGAUGACACCTT-3'。非特异性siRNA(CtrlsiRNA)为吉玛公司提供。利用LipofectamineTM2000将cofilin-1-siRNA 和非特异性siRNA(Ctrl-siRNA)转染Huh-7 细胞形成cofilin-1-siRNA 组和Ctrl-siRNA 组，未转染Huh-7 细胞为空白对照组。具体操作如下:将1×通用缓冲液125 μL，加入到2.5 nmol 的双链siRNA 中，得到siRNA 母液，浓度为20 μmol/L。工作母液放置于90 ℃2 min，自然冷却至室温，然后放于4 ℃过夜备用。转染前一天，细胞传代培养于6 孔板中，培养24 h 至细胞铺满孔底的40%～50%。将6 μL 20 μmol/L 的siRNA 双链与100 μL 无血清DMEM 混合于无菌的eppendoff 管中。LipofectamineTM2000 试剂(1 μg/μL)摇匀取3 μL，与100 μL 无血清DMEM 混合于另一无菌eppendorf管中。将上述两管液体在5 min 内混合，并混匀，室温静置至少20 min，形成siRNA-Lipofectamine 复合物。6 孔板细胞弃去培养液，加入含10%FCS 的DMEM 1 mL，然后将上述配制的混合物200 μL 分别加入各孔中，使转染终浓度为100 nmol/L。然后将细胞于37 ℃，5%CO2的细胞孵箱中孵育48 h，收集细胞进行检测。

1.5 Western-blot 检测Huh-7 细胞cofilin-1 蛋白的表达 各个样品取20 μg 加入上样孔。12%的SDS-PAGE 胶分离样品，转膜，PVDF 膜入5%PBST 脱脂奶粉液中，室温封闭2 h。然后将PVDF膜依照Mark 裁剪成条，小鼠抗人Cofilin-1 抗体按1∶200 稀释，小鼠抗人GAPDH 抗体按1∶10000 稀释，分别孵育对应的膜上，4 ℃过夜。次日，用0.5%PBST 分 别 洗 涤PVDF 膜3 次，10 min/次。HRP 标记的羊抗兔IgG 抗体1 ∶2000 稀释，HRP标记的羊抗小鼠IgG 抗体1∶2000 稀释，孵育对应膜上，室温1 h。然后PBST 洗膜3 次，10 min/次。ECL，暗室曝光后显影定影，扫描胶片。凝胶图像分析:将胶片进行扫描，用Image J 软件对胶片进行灰度分析，计算3 组细胞中目标蛋白和内参的电泳条带灰度比值，对不同细胞中目标蛋白的相对表达水平进行分析。

1.6 体外细胞迁移实验 用0.25%胰酶消化细胞，用含10%FBS 的DMEM 培养基收集细胞至1.5 mL EP 管中，用不含血清的培养基洗细胞3 次，细胞计数，用无血清培养基(含0.1%BSA)配成5×105个/mL 的细胞悬液。在24 孔培养板中加入500 μL含有10%FBS 的DMEM 培养基，将Transwell 小室放入，为了免减弱迁移作用，下层培养基和小室间不要产生气泡，在小室内加入200 μL 细胞悬液，盖好培养板。将Transwell 培养板放置于5%CO2、37 ℃培养箱中，孵育8 h。取出Transwell 小室，去除小室内的液体，将小室放入加有500 μL 4%多聚甲醛的孔中固定，室温下1 h 后去除小室内的液体，放入加有500 μL 0.1%结晶紫的孔中，使膜浸没在结晶紫中，染色30 min，PBS 洗2 遍，棉签擦去小室内的细胞(不可碰触小室的外底部)，PBS 洗2 遍。晾干，将小室放入干净的24 孔培养板中，在倒置显微镜下观察。随机取5 个高倍镜视野，照相、计数。

1.7 体外细胞侵袭实验 将BD matrigel(冻存于－20 ℃冰箱)放到4 ℃融解，过夜。用预冷的Tip头、移液管，将融解好的Matrigel 用4 ℃的无血清培养基以1∶8 稀释，混匀。在Transwell 小室内均匀铺100 μL 稀释的Matrigel，Transwell 小室放入24 孔培养板中，在5%CO2、37 ℃培养箱中，孵育4 h，使之形成一层均匀的薄层凝胶。用无血清培养基轻洗薄层凝胶2 遍。配制2.5×106个/mL 的细胞悬液，在小室内加入200 μL 细胞悬液，盖好培养板。Transwell 培养板放置于5%CO2、37 ℃培养箱中，孵育14 h。其他步骤与方法同迁移实验。

1.8 统计学分析 采用SPSS 13.0 统计软件进行数据分析。定量资料用均数±标准差)表示，组间均值的比较采用两独立样本t 检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肝癌组织与癌旁组织中Cofilin-1 mRNA 表达的检测结果 Cofilin-1 在肝癌组织的表达显著高于癌旁组织［(3.523±0.412)vs(0.698±0.156)］，差异有统计学意义(P ＜0.05)。

2.2 Cofilin-1-siRNA 转染对Huh-7 细胞Cofilin-1蛋白表达的影响 干扰6 h 后，观察羧基荧光素(Carboxyfluorescein，FAM)荧光图，干扰效果达90%以上，见图1。Cofilin-1-siRNA 组Cofilin-1 的蛋白量为0.558±0.033，明显低于Ctrl-siRNA 组0.933±0.015 与未转染组0.961±0.020，差异均有统计学意义(P ＜0.05);Ctrl-siRNA 组与未转染组的差异无统计学意义(P ＞0.05)。见图2。

图1 Cofilin-1-siRNA 转染Huh-7 细胞的荧光图(×100)Figure 1 Immunofluorescence figures of Huh-7 cells tranfected with FAM Cofilin-1-siRNA(×100)

图2 Huh-7 细胞Cofilin-1 蛋白的Western-blot 检测结果Figure 2 Western blot analysis of the expression of Cofilin-1 protein in Huh-7 cells

2.3 Cofilin-1-siRNA 转染对Huh-7 细胞体外迁移的影响 体外细胞迁移实验结果显示:Cofilin-1-siRNA 组穿膜Huh-7 细胞数为［(58.50±1.78)个］，明显低于Ctrl-siRNA 组［(79.00±1.33)个］和未转染组［(74.50±1.35)个］，差异有统计学意义(P ＜0.05);Ctrl-siRNA 组与未转染组穿膜Huh-7 细胞数的差异无统计学意义(P ＞0.05)，见图3。

2.4 Cofilin-1-siRNA 转染对Huh-7 细胞体外侵袭的影响 体外细胞侵袭实验结果显示:Cofilin-1-siRNA 组穿膜Huh-7 细胞数为［(36.50±0.83)个］，明显低于Ctrl-siRNA 组［(60.20±1.60)个］和未转染组［(51.50±1.14)个］，差异均有统计学意义(P ＜0.05);Ctrl-siRNA 组与未转染组穿膜Huh-7 细胞数的差异无统计学意义(P ＞0.05)。见图4。

图3 3 组细胞Transwell 迁移实验图(×100)Figure 3 The figures of transwell migration assay of cells in the three groups(×100)

图4 3 组细胞Transwell 侵袭实验图(×100)Figure 4 The figures of transwell invasion assay of cells in the three groups(×100)

3 讨 论

HCC 是最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在各种类型恶性肿瘤中更是位居前列［1］。而目前的治疗效果不理想，因此，寻找具有HCC 治疗价值的药物靶点，将对HCC 的临床治疗奠定基础。

Cofilin 基因具有2 种亚型，Cofilin-1 是其中之一，在脑和肝脏表达丰度最高。Cofilin-1 在促进肌动蛋白解聚/聚合和肌动蛋白丝的快速周转中发挥重要 作 用［5］。在 胰 腺 癌［10］、口 腔 鳞 癌［11］、乳 腺癌［12］、胆囊癌［13］、肺癌［14］、卵巢癌［8］中，Cofilin-1 呈过表达。Cofilin-1 可预测早期卵巢上皮性癌(卵巢癌)治疗成功者的预后，Cofilin-1 表达低的患者生存期要长于Cofilin-1 表达高的患者［8］。由此可见，Cofilin-1的表达与肿瘤的迁移、侵袭有关。本研究30 例肝癌患者中Cofilin-1 在癌组织中的表达高于癌旁组织，表明Cofilin-1 基因高表达可能与肝癌发生、发展密切相关。

肌动蛋白细胞骨架的重组参与肿瘤进展、细胞运动、细胞粘着、细胞侵袭和血管生成。在癌细胞中抑制Cofilin-1 活性能使细胞运动能力下降［6］。下调Cofilin-1 蛋白表达的降低了侵袭伪足组装和的稳定性，表明Cofilin-1 在细胞侵袭了起至关重要的作用［7，15－16］。RNA 干扰已经成为功能基因组研究的有力工具，本研究采用Cofilin-1-siRNA 干扰Huh-7细胞中Cofilin-1 基因表达，结果提示:Cofilin-1-siRNA 组Cofilin-1 的蛋白量明显低于Ctrl-siRNA 组与未转染组，差异有统计学意义(P ＜0.05)，这说明本研究采用的Cofilin-1-siRNA 干扰效果好。在此基础上，进一步应用体外细胞迁移实验检测Cofilin-1-siRNA 干扰细胞的迁移能力，结果显示Cofilin-1-siRNA 组细胞的迁移修复能力远低于Ctrl-siRNA 组与未转染组，证明了Cofilin-1 表达受抑制后Huh-7细胞的迁移能力也受到抑制。本研究应用Transwell小室实验证实了Cofilin-1 基因沉默后肝癌细胞Huh-7 侵袭能力均明显受到了抑制，Cofilin-1-siRNA组的穿膜细胞明显低于Ctrl-siRNA 组与未转染组，提示Cofilin-1 在肝癌侵袭过程中起重要作用。为进一步研究Cofilin-1 基因在肿瘤转移中的作用及机制提供实验依据。

总之，本研究初步发现Cofilin-1 基因高表达与肝癌发生、发展密切相关。通过RNA 干扰Cofilin-1基因表达后，可以在体外抑制肝癌Huh-7 细胞的迁移和侵袭，提示Cofilin-1 基因参与肝癌转移过程，可能是肝癌基因治疗的靶点，而Cofilin-1 基因发挥其作用的具体分子机制我们正在进一步研究。

［1］ DeSantis CE，Lin CC，Mariotto AB，et al.Cancer treatment and survivorship statistitics［J］.CA Cancer J Clin，2014，64(4):252-254.

［2］ 林凯璇，穆 洪，孙玉琳，等.肝细胞肝癌重要表面标志的表达和定位［J］.医学研究生学报，2013，26(1):4-8.

［3］ Ho CM，Wu CY，Lee PH，et al.Analysis of the risk factors of untransplantable recurrence after primary curative resection for patients with hepatocellular carcinoma［J］.Ann Surg Oncol，2013，20(8):2526-2533.

［4］ 韩菲菲，王婷婷，陈国千.高迁移率族蛋白B1 在肝细胞癌组织中的表达改变［J］.医学研究生学报，2014，27(4):344-346.

［5］ Chen H，Bernstein BW，Bamburg JR.Regulating actin-filament dynamics in vivo［J］.Trends Biochem Sci，2000，25(1):19-23.

［6］ Yamaguchi H，Lorenz M，Kempiak S，et al.Molecular mechanisms of invadopodium formation:the role of the N-WASP-Arp2/3 complex pathway and cofilin［J］.J Cell Biol，2005，168(3):441-452.

［7］ Keezer SE，Krutzsch HC，et al.Angiogenesis inhibitors target the endothelial cell cytoskeleton through altered regulation of heat shock protein 27 and cofilin［J］.Cancer Res，2003，63(19):6405-6412.

［8］ Nishimura S，Tsuda H，Kataoka F，et al.Overexpression of cofilin 1 can predict progression-free survival in patients with epithelial ovarian cancer receiving standard therapy［J］.Hum Pathol，2011，42(4):516-521.

［9］ Zhang Y，Tong X.Expression of the actin-binding proteins indicates that cofilin and fascin are related to breast tumour size［J］.J Int Med Res，2010，38(3):1042-1048.

［10］ Wang Y，Kuramitsu Y，Ueno T，et al.Differential expression of up-regulated cofilin-1 and down-regulated cofilin-2 characteristic of pancreatic cancer tissues［J］.Oncol Rep，2011，26(6):1595-1599.

［11］ Chanthammachat P，Promwikorn W，Pruegsanusak K，et al.Comparative proteomic analysis of oral squamous cell carcinoma and adjacent non-tumour tissue from Thailand［J］.Arch Oral Biol，2013，58(11):1677-1685.

［12］ Shaheed SU，Rustogi N，Scally A，et al.Identification of stagespecific breast markers using quantitative proteomics［J］.J Proteome Res，2013，12(12):5696-5708.

［13］ Yang ZL，Miao X，Xiong L，et al.CFL1 and Arp3 are biomarkers for metastasis and poor prognosis 12 of squamous cell/adenosquamous carcinomas and adenocarcinomas of gallbladder［J］.Cancer Invest，2013，31(2):132-139.

［14］ Peng XC，Gong FM，Zhao YW，et al.Comparative proteomic approach identifies PKM2 and cofilin-1 as potential diagnostic，prognostic and therapeutic targets for pulmonary adenocarcinoma［J］.PLoS One，2011，6(11):e27309.

［15］ Garg P，Verma R，Cook L，et al.Actin-depolymerizing factor cofilin-1 is necessary in maintaining mature podocyte architecture［J］.J Biol Chem，2010，285(29):22676-22688.

［16］ Pfaendtner J，Dela Cruz EM.Actin filament remodeling by actin depolymerization factor/cofilin［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107(16):239-254.