慢性丙型肝炎患者外周血DNT细胞与HCV－RNA病毒载量关系的研究

马寅芙，李首庆，刘 磊，孙牧男，谭 岩

（吉林省人民医院，吉林长春130021）

慢性丙型肝炎患者外周血DNT细胞与HCV－RNA病毒载量关系的研究

马寅芙，李首庆，刘 磊，孙牧男，谭 岩＊

（吉林省人民医院，吉林长春130021）

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染机体后所引起的传染性疾病。大多数的丙型肝炎患者感染后转为慢性，病毒在体内持续存在，慢性丙型肝炎是引起肝硬化和肝癌的重要原因之一。CD3＋CD4－CD8－T细胞（双阴性T细胞，DNT）是一种新发现的调节性T细胞亚群，研究发现其在移植排斥、自身免疫性疾病、肿瘤免疫、感染性疾病、过敏性疾病以及移植物抗宿主病等疾病中发挥重要作用［1］，成为近年来免疫学研究的热点之一。本文利用流式细胞术检测慢性丙型肝炎患者外周血中CD3，CD4，CD8及DNT细胞的表达，PCR方法检测HCV－RNA病毒载量，研究慢性丙型肝炎患者外周血中DNT细胞的表达与HCV－RNA病毒载量的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取我院2014年8月至2014年12月门诊及住院慢性丙型肝炎患者78例，男性33例，女性45例，年龄18－70岁。病例诊断标准符合2004年中华医学会传染病与寄生虫学分会、肝病学分会制定的《丙型肝炎防治指南》［2］。排除甲、乙型等肝炎其他病毒性疾病、自身免疫性肝病、药物及酒精性肝炎等。健康对照组25例，男12例，女13例，年龄28－66岁，为我院体检中心体检结果正常的健康人群。

1.2 标本采集和处理 患者空腹采集静脉血3ml入生化管，离心取血清进行PCR检测；1ml入EDTA抗凝管用于流式检测。

1.3 试剂和仪器 流式细胞仪美国Beckman Coulter Epics XL；荧光定量PCR仪美国ABI 7500。OptiLyse C溶血素购自美国贝克曼库尔特公司；荧光抗体FITC－CD4／PE－CD8／PE－CY5－CD3购自美国BD；HCV－RNA试剂盒购自上海科华有限公司。

1.4 荧光定量PCR检测HCV－RNA定量 参考上海科华《丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR－荧光探针法）》说明书操作。将检测结果分为两组：HCV－RNA＜1＋E003IU／ml，HCV－RNA≥1＋E003IU／ml。

1.5 流式细胞术检测T细胞亚群及DNT表达量管中加入100μl全血，加FITC－CD4／PE－CD8／PECY5－CD3抗体20μl，混匀室温避光孵育15分钟；加入1ml溶血素，混匀避光10分钟；加入1ml生理盐水，混匀1 500r／min离心5分钟；弃上清，加入500μl生理盐水混匀上机。

1.6 统计学处理 采用SPSS17统计软件进行数据分析。数据以均数±标准差（x—±s）表示，样本均数间差异比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCV－RNA病毒含量不同的慢性丙型肝炎患者T细胞亚群表达

慢性丙型肝炎患者无论病毒含量高低CD4＋T淋巴细胞比例及CD4＋／CD8＋比值均低于健康对照组差异有统计学意义（P＜0.05）；随着病毒含量的升高，CD4＋／CD8＋比值也在持续降低（P＜0.05）（如表1）。

2.2 HCV－RNA病毒含量不同的慢性丙型肝炎患者DNT细胞表达

慢性丙型肝炎患者无论病毒含量的高低其外周血DNT细胞的表达量均高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。随着丙肝病毒含量的升高，HCV－RNA≥1＋E003IU／ml的患者外周血中DNT细胞的表达量高于HCV－RNA＜1＋E003 IU／ml患者的表达量，差异有统计学意义（P＜0.05）（如表2）。

表1 HCV－RNA病毒含量不同的慢性丙型肝炎患者T细胞亚群表达

表2 HCV－RNA病毒含量不同的慢性丙型肝炎患者DNT细胞表达

3 讨论

丙型肝炎呈世界性分布，约80%的丙型肝炎患者为慢性化发展，约30%的患者发展为肝硬化、肝癌［3］。HCV－RNA是病毒复制的指标，临床通过HCV－RNA病毒含量的变化来判断病情，并在治疗药物的选择及判断疗效上也具有重要意义［4］。目前HCV的致病机制正在研究中，HCV感染后，体内T淋巴细胞缺失及功能紊乱，导致病毒持续感染，使丙型肝炎慢性化。有研究认为［5］，机体对HCV免疫应答低下是导致HCV感染慢性化的主要原因之一。本文研究结果显示慢性丙型肝炎患者CD4＋T细胞及CD4＋／CD8＋比值低于健康对照组，T淋巴细胞亚群比例异常，导致机体免疫功能紊乱，免疫处于抑制状态，清除病毒能力下降，从而导致HCV病毒持续感染。

DNT细胞最早发现于成年小鼠的脾脏及人的外周血中，它的含量很低，仅占小鼠和人的外周血淋巴细胞的1%－3%［6，7］。对于DNT细胞的来源和成熟途径尚不完全清楚。有研究发现DNT可能来源于胸腺pre－TCR DN细胞（DN3）［8］、CD8＋T细胞［9，10］、CD4＋T［11］、胸腺外器官［12，13］等。DNT细胞是一种特殊的调节T细胞，其在体内的免疫调节机制纵说纷纭。DNT细胞能下调高度活化的效应CD4＋T细胞和CD8＋T细胞的扩增和细胞因子的产生［14］，抑制B细胞、NK细胞的活化［15，16］。

病毒特异性CD8＋T淋巴细胞应答低下会导致循环病毒量增加，使病毒难以从机体内被清除，而导致肝炎的慢性化［17］。孙颖［18］等研究发现DNT细胞能够通过Fss／Fasl途径杀伤病毒特异性CD8＋T细胞。Zhang［19］等研究发现DNT细胞可杀伤B细胞、CD4＋T细胞和CD8＋T细胞。因此在慢性丙型肝炎患者体内，增高的DNT细胞抑制了CD4＋T细胞及特异性抗病毒CD8＋T细胞功能，机体清除HCV病毒能力下降，使病毒长期存在造成慢性感染。本文研究结果慢性丙型肝炎患者CD4＋T细胞比例下降，而CD8＋T细胞并未降低，可能是非抗病毒CD8＋T细胞增加，而特异性抗病毒CD8＋T细胞减少。

本文研究结果显示慢性丙肝患者T细胞DNT细胞表达明显高于健康对照组，并且随着HCVRNA载量的增加，慢性丙型肝炎患者外周血中DNT细胞表达与HCV－RNA病毒载量呈正相关。DNT细胞高表达使机体免疫应答能力减弱，使机体抗病毒能力降低，丙型肝炎病毒在体内持续复制呈现慢性发展。DNT细胞和T淋巴细胞亚群检测对慢性丙型肝炎患者免疫功能状态判断、病情评估、治疗效果中具有重要意义。

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2015－03－09）

1007－4287（2015）10－1754－03

中青年科技创新领军人才及团队项目，吉林省肿瘤生物治疗创新团队（20140519018JH）；吉林省科技厅青年科研基金项目（20140520037JH）

＊通讯作者