瘦素受体基因Gln223Arg多态性与2型糖尿病合并慢性肾功衰竭关系

李 莹，孙玉鸿，王英敏，隋洪玉，李雅江，斗 章，高英英，徐 辉＊

（佳木斯大学1.附属第一医院；2.基础医学院；3.《黑龙江医药科学》编辑部，黑龙江佳木斯154002）

瘦素受体基因Gln223Arg多态性与2型糖尿病合并慢性肾功衰竭关系

李 莹1，孙玉鸿1，王英敏3，隋洪玉2，李雅江1，斗 章1，高英英1，徐 辉2＊

（佳木斯大学1.附属第一医院；2.基础医学院；3.《黑龙江医药科学》编辑部，黑龙江佳木斯154002）

目的探讨瘦素受体基因Gln223Arg多态性与2型糖尿病合并慢性肾功衰竭关系。方法 采用聚合酶链反应及限制性片段长度多态性方法（PCR－RFLP）分别测定126例2型糖尿病、108例2型糖尿病合并慢性肾功衰竭和185例对照组样本的瘦素受体基因Gln223Arg的基因型，同时检测各组不同基因型样本的血清瘦素水平。结果 2型糖尿病合并慢性肾功衰竭组与正常对照组瘦素受体基因Gln223Arg基因型频率及等位基因频率比较差异有显著性（P＜0.01）。糖尿病组与正常对照组瘦素受体基因Gln223Arg基因型及等位基因分布频率差异显著性（P＜0.05）。2型糖尿病合并慢性肾功衰竭组中GG基因型与AA＋AG基因型血清瘦素水平比较差异有显著性（P＜0.05）。相同基因型样本的血清瘦素水平组间比较，任意两组比较均有差异（P＜0.05）。结论 瘦素受体基因Gln223Arg多态性与2型糖尿病合并慢性肾功衰竭相关。

2型糖尿病；慢性肾功衰竭；瘦素；Gln223Arg；遗传学

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1670）

作为一种常见的内分泌代谢性疾病，2型糖尿病（T2DM：Type 2Diabetes Mellitus）近10年来，发病率逐年增高，也是一种世界范围的流行病［1］。我国DM发病率呈逐年上升趋势，DM引起肾脏的损害是2型DM患者的主要并发症。糖尿病肾病是糖尿病患者死亡的主要原因之一［2］。本研究应用分子生物学技术对2型DM及2型DM合并慢性肾功能衰竭患者瘦素（lep）受体基因Gln223Arg的多态性进行分析，旨在探讨瘦素系统在糖尿病合并肾功衰竭发生、发展过程中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究对象

所有病例来源于2012年1月至2012年12月在我院肾内科、内分泌科收住院的2型DM及2型DM合并慢性肾功能衰竭患者，均无血缘关系，其中2型DM男性81例，女性45例，平均年龄50.7± 6.2岁；2型DM合并慢性肾功能衰竭患者男性74例，女性34例，平均年龄55.7±3.4岁。对照组为本院同时期健康体检者，平均年龄42.5±2.9岁；经临床体检及实验室检查，排除心、肝、肾、脑等器质性病变以及高血压、糖尿病、各种炎症、肿瘤以及免疫性疾病，且糖耐量正常者，男性104例，女性81例，平均年龄47.8±3.2岁，其年龄、性别方面均与病例组无明显差别（P＞0.05）。

1.2 实验方法

受试者夜间禁食12小时，晨起抽取外周静脉血2ml，经EDTA抗凝离心得白细胞，－80℃低温保存，待用。常规用苯酚－氯仿法提取外周血白细胞基因组DNA。参考Richert L［3］等所采用的引物序列，并经过引物设计软件优化设计引物，引物序列如下：上游：5’－ACC CTT TAA GCT GGG TGT CCC AAA TGA－3＇，下游：5’－AGC TAG CAA ATA TTT TTG TAA GCA ATT－3＇。PCR反应扩增产物长度为416bp，以限制性内切酶MspI（New England Biolabs）在37℃酶解PCR产物4h，电泳后观察结果。上述采血时同时抽取静脉血3ml，等待血液凝固后通过离心法提取血清并放置在－70℃低温冰箱中待检，最后测定采用放射免疫分析法进行。

1.3 统计学分析

用Hardy Weinberg遗传平衡定律确认各亚型基因频率已达遗传平衡具有群体代表性。采用SPSS12.0（Statistical Product and Service Solutions）统计分析软件对数据进行处理，用¯x±s来表示数据，采用F检验或t检验进行组内比较，当P＜0.05时，表示有统计学意义，两个分类变量的关联性分析采用卡方检验，以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR－RFLP检测

紫外透视仪观察结果显示有3种带型：基因型为AA时，酶切后为416bp一条带；GG型酶切后为293bp、123bp两条带；AG型酶切后为416bp、293 bp、123bp三条带（见图1）。

2.2 基因型分布频率与瘦素受体等位基因之间的关系

如表1所示，Gln223Arg的基因型及等位基因分布频率在糖尿病组与正常对照组比较有统计学意义，P＜0.01，AA＋AG及GG基因型分布频率正常对照组与糖尿病合并肾功衰竭组比较具有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 糖尿病合并肾功衰竭组、糖尿病组及正常对照组不同瘦素受体基因型血清瘦素水平比较见表2。

2型糖尿病合并慢性肾功衰竭组，GG基因型与AA＋AG基因型血清瘦素水平比较有差异，t＝2.189，P＝0.031，P＜0.05。2型糖尿病组，GG基因型与AA＋AG基因型血清瘦素水平比较有差异，t＝3.237，P＝0.002，P＜0.01。对照组，GG基因型与AA＋AG基因型血清瘦素水平比较无差异，t＝1.477，P＝0.142＞0.05。

2.4 糖尿病合并肾功衰竭组、糖尿病组及正常对照组，三组相同瘦素受体Gln223Arg基因型血清瘦素（leptin）水平比较见表3。

分别从GG、AA＋AG基因型瘦素水平两两比较结果，三组中的任意两组比较均有差异，有统计学意义（P＜0.05）。

图1 瘦素受体基因Gln223Arg多态性电泳结果

表1 Gln223Arg基因型和等位基因频率分布

表2 瘦素受体Gln223Arg不同基因型血清瘦素（leptin）水平比较（ng／ml，¯x±s）

表3 三组相同瘦素受体Gln223Arg基因型血清瘦素水平比较（ng／ml，¯x±s）

3 讨论

病程在10－20年的T2DM病人中超过50%有蛋白尿现象，肾脏发生肾小球硬化等特异性病理改变，如肾小管空泡变性、肾脏入球和出球小动脉硬化等。该病的病程严重程度几乎与糖尿病病程平行。这种糖尿病患者所特有的肾小球硬化与肾小球病变在医学上我们称为糖尿病性肾病［4，5］。由于该病患者造成肾功能衰竭者据国外有关资料表明比非糖尿病患者高17倍，是糖尿病患者死亡的主要原因之一［6，7］。经国外多项研究结果证明肥胖是2型DM发病的独立危险因素，尤其是腹型肥胖最为显著［8］。1994年，Zhang等利用定位克隆技术首次成功克隆出了小鼠的肥胖基因（ob基因）以及我们人类的同源基因序列，使人们认识到了瘦素（Leptin，lep）作为ob基因的蛋白产物的化学分子结构和生理作用［9］，lep是肥胖基因编码，由脂肪细胞分泌的前激素蛋白［10］。lep为肥胖基因的蛋白产物，是主要由脂肪组织分泌的激素。最初发现它具有控制食欲和促进能量消耗的作用，lep通过与中枢神经系统及周围器官的瘦素受体直接结合来调节体内的能量平衡、脂肪代谢及某些内分泌功能［11］。近年来研究发现它还具有调节炎症反应、活化巨噬细胞、促进血管生成、促成纤维细胞生长、胶原合成等功能，与炎症性结肠疾病、恶性肿瘤、骨骼疾病、哮喘等疾病有密切关系［12］。瘦素受体（LEPR）是新近克隆的基因，目前LEPR基因存在多种多态性，这种多态性主要由于LEPR基因的核苷酸变异［13］，研究较多的变异有Gln223Arg、Lys109Arg、Lay656Asn等，这些多态性与肥胖、糖尿病、恶性肿瘤、骨质疏松、慢性阻塞性疾病等有一定相关性［3，14，15］。目前国内外学者对瘦素受体Gln223Arg基因多态性与2型糖尿病合并慢性肾功衰竭研究甚少。本研究表明：①2型糖尿病合并慢性肾功衰竭患者A、G等位基因分布频率为0.36和0.64，和2型糖尿病组0.20和0.80及正常对照组0.14和0.86比较有统计学意义（P＜0.001），上述等位基因多态可能与2型糖尿病合并慢性肾功衰竭有关。②不同基因型血清瘦素水平比较，2型糖尿病组合并肾功衰竭及2型糖尿病组中，GG基因型与AA＋AG基因型血清瘦素比较均有差异，t＝3.237，P＝0.002，P＜0.05。对照组GG基因型与AA＋AG基因型无差异，t＝1.477，P＝0.142 P＞0.05。表明基因多态与瘦素水平有关，进一步表明A等位基因可能是2型糖尿病及2型糖尿病合并肾功衰竭的易感基因。③对于相同瘦素受体Gln223Arg基因型检测瘦素水平对比，2型糖尿病合并肾功衰竭、2型糖尿病、正常对照组间瘦素浓度具有显著差异（P＜0.05），血清瘦素浓度在2型糖尿病合并肾衰患者显著高于2型糖尿病患者及正常对照组，2型糖尿病患者高于对照组，提示糖尿病患者存在高瘦素血症，随着肾脏功能的减低，肾脏清除瘦素能力减低，血清瘦素水平逐渐增高，进一步证明肾功能不全时，肾小球滤过功能减低或肾小管降解功能下降，导致肾脏清除瘦素的能力减低，过高的血清瘦素还会在肾组织中集聚，进一步使肾脏损伤［6］。我们的数据表明，瘦素受体基因Gln223Arg多态性与2型糖尿病合并肾功衰竭的发生显著相关。同时，我们发现，瘦素受体Gln223Arg多态性与2型糖尿病患者及其合并肾功衰竭患者血浆瘦素浓度存在关联。本研究从基因水平初步分析了瘦素受体基因在2型糖尿病合并慢性肾功衰竭的发生过程可能发挥作用，这为今后治疗糖尿病肾病提供了新思路。全面分析瘦素受体基因在2型糖尿病合并慢性肾功衰竭发生的作用机制，尚需进一步的大样本的研究来证实。

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Relationship between polymorphism of leptin receptor gene Gln223Arg and type 2 diabetes mellitus with chronic renal fail－ure

LI Ying，SUN Yu－hong，WANG Ying－min，et al.
（First Afficiated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154002，China）

ObjectiveTo investigate the relationship of polymorphism of leptin receptor gene Gln223Arg with type 2diabetes mellitus with chronic renal failure.Methods By using polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism（PCR－RFLP），we respectively measured leptin receptor gene Gln223Arg in 126cases of type 2diabetes mellitus patients，108cases of type 2diabetes mellitus with chronic renal failure and 185patients with control group sample，Simultaneously detected leptin levels in each genotype samples.Results The genotype freguency of Gln223Arg polymorphism in leptin receptor gene had significant difference between 108cases of type 2diabetes mellitus and renal failure with normal control groups，P＜0.01，The genotype freguency of Gln223Arg polymorphism in leptin receptor gene had significant difference between patients with type 2diabetes mellitus without renal failure and controls，P＜0.05.There are significant difference between GG genotype and AA＋AG genotype in type 2diabetes mellitus with chronic renal failure group in serum leptin levels，P＜0.05.Compared with three identical leptin receptor Gln223Arg gene of serum leptin levels，compared results Separately from the GG，AA＋AG genotype of serum leptin levels.Comparison of any two sets，there are significant difference in type 2diabetes mellitus with renal failure，type 2 diabetes without renal failure and normal control group，P＜0.05.Conclusion Gln223Arg polymorphism in leptin receptor gene is associated with type 2diabetes mellitus with chronic renal failure.

type 2diabetes；chronic renal failure；serum leptin；Gln223Arg gene variation；Genetics

R587.1

A

李莹（1977－），女，黑龙江佳木斯人，副主任医师，硕士研究生。

2014－11－25）

1007－4287（2015）10－1670－04

本课题为佳木斯大学课题（S2009－053）

＊通讯作者