DC、CIK联合培养对肿瘤细胞杀伤作用的实验研究

赵 鑫，常 颖，刘玉侠，卢卫平，王 宝，王 哲，于 鸿，王启文，王 斌＊

DC、CIK联合培养对肿瘤细胞杀伤作用的实验研究

赵 鑫1，常 颖1，刘玉侠2，卢卫平1，王 宝1，王 哲1，于 鸿2，王启文1，王 斌1＊

（1.吉林省肿瘤医院，吉林长春130012；2.吉林省肿瘤防治研究所）

目的探讨DC（dendritic cells）、CIK（cytokine－induced killer cells）联合培养对肺腺癌细胞A549的杀伤活性的影响，并与单独CIK对A549杀伤活性进行比较，为肿瘤生物治疗提供有效方法。方法 分别培养DC、CIK细胞，经鉴定后进行联合培养，联合培养3天后，对A549细胞进行杀伤活性实验，检测DC联合CIK及单独CIK对A549的杀伤活性，同时用流式细胞检测DC、CIK联合培养细胞及单独CIK细胞中淋巴细胞亚群的表达。结果 DC联合CIK对A549的杀伤活性为88.38%，CIK对A549的杀伤活性为66.24%，两者对A549的杀伤活性比较有显著差异（P＜0.01）；DC、CIK联合培养的淋巴细胞亚群中的CD3＋、CD4＋、NK、NKT、CD3＋HLA－DR＋、CD8＋CD28＋的数量均高于CIK细胞。结论 DC、CIK联合培养对肺癌细胞A549的杀伤活性明显高于单独CIK对A549的杀伤活性（P＜0.01）；抗肿瘤淋巴细胞（CD3＋、CD4＋、NK、NKT、CD3＋HLA－DR＋、CD8＋CD28＋）数量也明显高于CIK细胞。

树突状细胞；CIK细胞；T淋巴细胞亚群；杀伤活性

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1636）

树突状细胞（dendritic cell，DC）是人体内抗原递呈能力极强的抗原递呈细胞，它可以通过捕获，加工肿瘤抗原，并将其递呈给T淋巴细胞，激活机体的免疫系统主动攻击肿瘤。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine－induced killer cell，CIK）是经多种细胞因子体外诱导的以CD3＋CD56＋细胞为主的，具有强大的抗肿瘤活性的广谱抗肿瘤细胞。本实验利用DC、CIK细胞各自的抗肿瘤特性将DC、CIK联合培养，检测其体外对肺癌细胞的杀伤活性，并与单纯CIK细胞对肺癌细胞的杀伤活性进行比较，同时检测它们的淋巴细胞亚群产生的数量，分析T淋巴细胞亚群数量与杀伤活性的关系，为肿瘤病人生物治疗的选择提供数据。

1 材料与方法

1.1 材料

淋巴细胞分离液：购于天津灏洋生物制品科技责任有限公司；GM－CSF，TNF－α，IL－4：购于Peprotech公司；IMDM培养基：GIBCO公司；胎牛血清：购于天津康源公司；IL－2：购于北京四环生物制药有限公司；anti－CD3Ab：Biolegend公司。anti－hunman CD3－FITC，anti－hunman CD16、CD56－PE，购自BD公司；IFN－γ：购于上海凯茂生物医药有限公司；CD3＋、CD4＋、NK、NKT、CD3＋HLA－DR＋、CD8＋CD28＋荧光标记单克隆抗体：购自美国BECKMAN COULTER公司；CCK8：购于上海同仁化学研究所。

1.2 肺腺癌细胞株A549

吉林省肿瘤防治研究所保存。

1.3 实验设备

低温高速离心机，SORVALL公司；HERA CEEL 240iCO2培养箱，Thermo Scientific公司；全自动酶标仪，芬兰雷勃公司；流式细胞仪，BD公司。

1.4 树突状细胞的体外诱导、培养

1.4.1 分离人外周血单核细胞 用Ficoll梯度密度离心法分离人外周血单核细胞，调细胞数为1× 106／ml，加到含10%胎牛血清的IMDM培养液中，放入250ml细胞培养瓶中培养。

1.4.2 以上分离的单核细胞培养1天后，加入GM－CSF（100ng／ml），IL－4（50ng／ml），TNF－α（10 ng／ml）等细胞因子，放入37℃，5%CO2培养箱内培养，每3天半量换液并补加细胞因子，诱导DC生成，7天后进行细胞表型鉴定

1.5 CIK细胞的诱导

将以上提取的外周血单核细胞培养1天后，加入IFN－r anti－humanCD3、IL－1a、IL－2等细胞因子，培养3天后分瓶，同时补加IL－2，7天后进行CIK表型鉴定。

1.6 DC、CIK联合培养

将以上经过鉴定的DC、CIK按1∶5的比例联合培养，3天后进行抗肺腺癌细胞A549体外杀伤实验，同时检测T淋巴细胞亚群数量的表达。

1.6.1 培养肺腺癌细胞株A549 将在液氮中冻存的A549细胞复苏后用含10%IMDM的培养基培养至对数生长期，用0.25%胰酶消化，IMDM培养液洗涤后，调整细胞数为5×104／ml，接种到96孔细胞培养板，每孔100μl／孔，过夜培养。

1.6.2 DC联合CIK以及单独CIK对A549杀伤活性实验 将联合培养的DC－CIK及CIK分别计数，调整细胞数为5×106／ml，按以下设计加入到已接种A549并贴壁的细胞培养板中，效应细胞（DCCIK，CIK）与靶细胞（A549）的比例为50∶1，每组6复孔。

实验分组：①DC－CIK；②CIK；③DC－CIK＋A549；④CIK＋A549；⑤A549。

以上细胞共培养24小时，培养结束前4小时加CCK8，培养结束后，用酶标仪检测492nm处各组光密度（OD）值，计算杀伤活性。

杀伤活性计算方法：杀伤活性＝［1－（实验组OD值－效应细胞OD值／靶细胞OD值）］×100% 1.6.3 检测DC－CIK及CIK细胞中T淋巴细胞亚群 采用四色荧光标记法标记DC－CIK及CIK细胞［1］，上流式细胞仪检测CD3＋、CD4＋、CD8＋、NK、NKT、活化T、活化B、CD8＋CD28＋的表达，用Cell Quest Pro软件分析淋巴细胞群体百分含量。

1.7 统计学处理

应用SPSS V16.0统计软件，数据用x—±s表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DC－CIK以及CIK对A549杀伤活性比较，见表1。

表1 DC－CIK以及CIK对A549杀伤活性

2.2 DC－CIK联合培养及CIK单独培养的淋巴细胞亚群数值比较，见表2。

表2 DC－CIK联合培养及CIK单独培养的淋巴细胞亚群数值

3 讨论

目前，生物疗法在恶性肿瘤的治疗中发挥着重要作用，免疫治疗作为生物治疗的组成部分，在肿瘤治疗中起着尤为重要的作用。肿瘤免疫治疗的主要目的是诱导T细胞免疫反应来控制和清除肿瘤，而这种免疫反应的产生需要专职抗原递呈细胞（antigen－presenting cell，APC）的抗原递呈作用。树突状细胞（dendritic cells，DC）是目前发现体内最强的专职APC［2，3］，它可以激活初始型T淋巴细胞参与抗肿瘤反应，在肿瘤的免疫治疗中发挥重要作用［4，5］。细胞因子激活的杀伤细胞（cytokine induced killer cells，CIK）是一种抗肿瘤作用极强的肿瘤杀伤细胞［6，7］，由于其兼具有NK细胞无MHC限制性的杀瘤特点，以及T细胞特异性杀伤肿瘤细胞的功能，同样在恶性肿瘤的治疗中发挥着重要作用。本实验利用DC及CIK各自的抗肿瘤特性，将两种抗肿瘤细胞共同培养，检测其对肺腺癌细胞A549的杀伤活性，并与单独CIK抗A549活性进行比较，为肿瘤生物治疗提供有效方法。

本实验通过DC联合CIK对肺腺癌细胞A549进行杀伤活性实验并与单独CIK对549的杀伤活性进行比较，证明DC联合CIK对A549的杀伤活性明显高于单独CIK的作用（P＜0.01），说明DC、CIK联合培养对肿瘤的杀伤作用起到了相加的作用。另外，本实验通过检查DC联合CIK以及单独CIK中淋巴细胞亚群的表达，证明DC－CIK细胞中CD3＋、CD4＋、NK、NKT、CD3＋HLA－DR＋、CD8＋CD28＋等抗肿瘤细胞数量均高于CIK细胞中的表达，这对DC－CIK抗肿瘤活性高于CIK的作用提供了支持。

淋巴细胞抗肿瘤作用的主要细胞是T淋巴细胞。CD3＋细胞是T淋巴细胞亚群的总和，在机体的免疫应答中起着重要作用，主要参与细胞免疫，而抗肿瘤的细胞主要为T淋巴细胞。T辅助细胞（CD3＋CD4＋）能识别抗原肽－MHC－II类复合物，并通过分泌细胞因子调节免疫应答，辅助诱导其它免疫细胞如杀伤性T细胞、巨噬细胞、B细胞等的增殖和分化，共同发挥抗肿瘤作用；NK细胞（CD3－CD16＋CD56＋）是机体重要的免疫细胞，其杀伤性无MHC限制，它主要作用的靶细胞有肿瘤细胞、病毒感染细胞等；NKT样淋巴细胞（CD3＋CD16＋CD56＋）因具有NK细胞无MHC限制的杀瘤特点以及T淋巴细胞特异性攻击肿瘤的特性而得名，它具有对CTL细胞和NK细胞抗肿瘤活性的调节能力，并能分泌TNF－α、IL－2、IFN－γ、IL－4等细胞因子；细胞毒性T淋巴细胞（CD8＋／CD28＋）是特异性抗肿瘤细胞，其数量越多，对肿瘤的杀伤力越强。DC－CIK除了高表达T淋巴细胞亚群外，其增殖率、分泌细胞因子等的能力也比CIK强［8－10］，这也是DC－CIK抗肿瘤活性高于CIK的重要因素。

本实验的结果证明，DC－CIK联合培养可以增加抗肿瘤细胞T淋巴细胞亚群百分比，所以其对肿瘤细胞的杀伤活性高于单独CIK，也证明DC、CIK联合培养可以起协同作用，提高抗肿瘤效果。

肺腺癌是肺癌的一个亚型，由于其易侵袭、转移和复发，成为临床治疗的难点。本实验以肺腺癌细胞A549作为DC－CIK及CIK的靶细胞进行体外杀伤活性研究，希望为肺腺癌的治疗提供除了手术、化疗、放疗等常规治疗以外的治疗方法，为肺腺癌的治疗提供一种选择，提高肺腺癌治疗的总体疗效。

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Experiment study of killing effect of DC and CIK co－cultured on tumor cells

ZHAO Xin，CHANG Ying，LIU Yu－xia，etal.（Jilin Province Tumor Hospital，Changchun130012，China）

ObjectiveTo discussion of cytotoxicity effects of DC（dendritic cells）and CIK（cytokine－induced cells）co－cultured on lung adenocarcinoma cell line A549，and Compare with CIK alone on A549killing activity，Provide an effective method for tumor biotherapy.Methods respectively cultured DC，CIK cell，and co－cultured after the identification，after 3days，to killing activity experiments on A549cell，detect cytotoxicity of DC joint CIK and separate CIK against A549，While using flow cytometry detect lymphocyte subsets expression of DC joint CIK and CIK alone.Results The cytotoxicity of DC joint CIK on A549was 88.38%，CIK was 66.24%，there were significant differences of cytotoxic activity on A549（P＜0.01）between，the number of lymphocyte subsets（CD3＋，CD4＋，NK，NKT，CD3＋HLADR＋，CD8＋CD28＋cell）of DC joint CIK was significantly higher than CIK.Conclusion The killing activity of DC and CIK co－cultured on A549lung cancer has significantly higher than that of single CIK cytotoxicity on A549（P＜0.01）.

dendritic cells；CIK cells；T lymphocyte subsets；killing activity

R734.2

A

2014－09－07）

1007－4287（2015）10－1636－03

＊通讯作者