麝香酮对大鼠骨髓间充质干细胞成骨能力的影响分析

刘敏婕，刘朋飞，赵 雷

（1.暨南大学第二临床医学院·深圳市人民医院a.手术室；b.麻醉科，广东深圳518020；2.吉林大学药学院再生医学系，吉林长春130021）

麝香酮对大鼠骨髓间充质干细胞成骨能力的影响分析

刘敏婕1a，刘朋飞2＊，赵 雷1b＊

（1.暨南大学第二临床医学院·深圳市人民医院a.手术室；b.麻醉科，广东深圳518020；2.吉林大学药学院再生医学系，吉林长春130021）

目的探索麝香酮对大鼠骨髓间充质干细胞成骨能力的影响，为骨髓间充质干细胞在骨损伤修复方面的应用开发新的方法。方法 采用密度梯度离心法，从大鼠骨髓中分离骨髓间充质干细胞，通过CCK－8方法对细胞的增殖能力进行评价，并进一步通过流式细胞术鉴定细胞表面的特异标记；用麝香酮（1.0mg／L）对细胞进行处理，分析处理后的骨髓间充质干细胞在成骨基因表达以及碱性磷酸酶活性方面的变化。结果 从大鼠骨髓中分离间充质干细胞可在体外条件下正常生长增殖，细胞CD29、CD44、CD90均呈阳性表达，CD45呈阴性表达，与正常间充质干细胞的表型相符合；同时，实时定量PCR结果显示，麝香酮处理后的细胞中，成骨基因ALP、Collagen I、Runx2和Osterix都有一定的上调趋势，同时，细胞中碱性磷酸酶的活性也有一定程度的升高。结论 麝香酮对骨髓间充质干细胞的成骨分化能力有一定的促进作用，在利用骨髓间充质干细胞进行骨损伤修复的过程中具有一定的应用价值。

骨髓间充质干细胞；麝香酮；成骨分化

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1618）

骨髓间充质干细胞（Bone marrow derived Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）是骨髓中存在的一类成体干细胞，具有多向分化潜能，而且在体外环境中具有较强的增殖能力和稳定的性能，同时易于获取［1－4］。这些优势使BMSCs在细胞工程、组织工程等方面均得到了广泛的应用，特别是在某些疾病的生物疗法中，占据了重要的地位［57］。

近些年，相关研究报道：BMSCs在骨向分化以及骨损伤修复方面具有着重要的应用前景［3，8，9］。所以，开发一种适合临床需求的干细胞治疗模式，对于BMSCs在骨损伤修复方面的应用有着重要的促进作用。麝香酮是麝香的主要香味成分，临床上主要用于治疗冠心病心绞痛、血管性头痛等，国内学者肖庆忠等［10］发现：用麝香酮含药血清对大鼠BMSCs进行处理后，细胞的增殖率、钙盐沉积量等均高于空白对照组。但是，这种含药动物血清的模式明显不适用与临床需求，同时，麝香酮对大鼠BMSCs的直接作用也尚不明确。所以，在本课题中，课题组主要采用麝香酮直接作用的方法处理大鼠BMSCs，分析处理后的BMSCs在成骨能力方面的变化，为麝香酮在促进BMSCs成骨能力方面的合理化应用提供一定的理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级Wistar大鼠，雄性，6－8周龄，体重160－180g，由吉林大学白求恩医学院动物中心提供，动物许可证号：SCXK－（吉）2007－0003。

1.2 主要试剂及仪器

DMEM／F12培养基、0.25%胰蛋白酶溶液均购自Gibco公司、胎牛血清（FBS）购自PAA公司，Percoll分离液购自Pharmacia公司，CCK－8试剂盒购自Dojindo公司，大鼠CD29－FITC、CD44－FITC、CD45－PE单克隆抗体购自BD公司，大鼠CD90－FITC单克隆抗体购自BioLegend公司，Trizol、RNA反转录试剂盒、SYBR荧光定量PCR试剂盒购自Takara公司，麝香酮购自Santa公司，碱性磷酸酶活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

IX－70倒置相差显微镜购自Olympus公司，FACSCalibur流式细胞仪购自BD公司，CFX96实时定量PCR仪购自BIO－RAD公司，EXL－808酶标检测仪购自BioTek公司。

1.3 大鼠BMSCs的分离培养和鉴定

分离获取雄性wistar大鼠股骨和胫骨，并用PBS冲洗出骨髓，收集骨髓液后，采用1.073g／ml的Percoll分离液分离BMSCs（3 000rpm离心20 min），BMSCs用PBS洗1次后，于37℃、5%CO2条件下，用含有10%FBS的DMEM／F12培养基培养，此时的BMSCs记为第1代。细胞隔日换液1次，培养4－5天后进行首次传代。

收集第3代的BMSCs进行增殖能力和表面标记的分析。以1×103cells／孔的数量将BMSCs接种到96孔板中，用CCK－8试剂盒检测BMSCs在24h、48h、72h和96h的增殖水平，评价BMSCs的增殖能力，以空白培养基作为背景组，实验组绝对吸光度值＝实验组吸光度值－空白组吸光度值，具体操作按CCK－8试剂盒说明书进行（n＝3）。将1×106BMSCs悬浮于0.1ml PBS中，大鼠CD29－FITC、CD44－FITC、CD45－PE、CD90－FITC均按1∶50的稀释比例与BMSCs混合，于室温孵育30min，用PBS清洗两次后，通过流式细胞仪检测细胞表面标记的表达情况。

1.4 麝香酮对BMSCs成骨基因的表达影响

将麝香酮以1.0mg／L的浓度加入到BMSCs的培养基中，培养48h，收集培养后的细胞，用Trizol裂解，提取细胞RNA，并通过反转录试剂盒获得基因组cDNA，采用实时定量PCR仪检测细胞中成骨基因ALP、Collagen I、RunX2和Osterix的表达程度，具体操作均按照试剂盒说明书进行，实时定量PCR所用引物（5’－3’）如下：

ALP F－AGATGGACAAGTTCCCCTTG

R－ACACAAGTAGGCAGTGGCAGT

Collagen I F－TGGAAGAGCGGAGACTACTGGATT

R－TCTGGACGTTAGCGGTGTTGG

Runx2F－CTATCCAGCCACCTTCACTTACA

R－TCGCCAGACAGACTCATCCA

Osterix F－TATGCCAATGACTACCCACCCTT

R－TTGCCCACTATTGCCAACTGC

GAPDH F－GCCAGCCTCGTCTCATAGACA

R－AGAGAAGGCAGCCCTGGTAAC

1.5 麝香酮对BMSCs成骨分化过程中碱性磷酸酶活性的影响

在基础培养基中，附加地塞米松1×10－4mM、β－甘油磷酸钠10mM、维生素C 50mg／L，配制成骨分化培养基。用成骨分化培养基培养BMSCs，同时，在培养基中加入1.0mg／L的麝香酮，分别在分化诱导第1天、第3天、第5天和第7天，对比检测麝香酮作用组与正常对照组（正常分化，无麝香酮作用）中BMSCs碱性磷酸酶（ALP）活性的变化，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.6 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析，各组数值以x—±s表示，各组之间比较采用t检验，P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠BMSCs的分离和鉴定结果

大鼠BMSCs在体外条件下主要呈长梭形、贴壁状态生长（图1A），同时，在培养的过程中细胞具有一定的增殖能力，可以在体外培养的环境中正常的增殖，在培养48h－72h的过程中，细胞的增殖速度较快（图1B）。

通过流式细胞仪检测可见：大鼠BMSCs的CD29、CD44、CD90均呈阳性表达，表达效率均在90%以上（CD29：97.3%，CD44：96.5%，CD90：93.4%），而细胞的CD45呈阴性表达，表达效率仅为0.84%，这一结果与正常的间充质干细胞表面标记相符合（图2）。

图1 大鼠BMSCs的形态及增殖评价结果

图2 大鼠BMSCs的表面标记鉴定结果

2.2 麝香酮对BMSCs成骨基因表达的影响

将未用麝香酮处理的BMSCs作为对照组，并将成骨基因在对照组的表达水平作为“1”，通过等比例比较麝香酮处理后的基因表达水平。通过结果分析可见：与未用麝香酮处理的细胞相比，在麝香酮的作用下，BMSCs的成骨基因ALP、Collagen I、RunX2和Osterix均有一定程度的上调（P＜0.05），但上调的程度各不一致（图3）。所以，麝香酮对于正常BMSCs成骨分化基因的表达有一定的提升作用。

图3 麝香酮作用下大鼠BMSCs成骨基因的表达变化（＊：P＜0.05）

2.3 麝香酮对BMSCs成骨分化过程中ALP活性的影响

通过成骨培养基的诱导分化，BMSCs的ALP活性逐渐升高。与未用麝香酮处理的细胞相比，在麝香酮作用1天后，BMSCs的ALP活性未见显著改变，但是，在麝香酮作用3天后，BMSCs的ALP活性与对照组相比有明显的升高（P＜0.05），而且，这种变化趋势在以后的分化过程中仍然可以稳定保持（图4）。由此说明，麝香酮在BMSCs成骨分化的过程中，对细胞中ALP的活性也具有一定的促进作用。

图4 麝香酮作用下大鼠BMSCs成骨分化过程中ALP活性的变化（＊：P＜0.05）

3 讨论

近年来，麝香酮对干细胞生物学特性的影响，已逐渐引起了研究人员的关注。谢兴文等［11］在构建颅骨缺损的大鼠模型后，同时给以BMSCs和麝香酮，结果显示：在麝香酮的作用下，BMSCs向损伤部位的迁移能力，明显优于未处理组。本课题组也在研究过程中发现：麝香酮对BMSCs的体内外迁移能力具有一定的促进作用，除骨损伤模型外，在急性肾损伤模型中，这种促进作用也得到了一定的体现［12］。在体外的研究的过程中，课题组还发现：麝香酮对BMSCs的增殖和某些细胞因子的分泌能力也具有的一定的促进作用，特别是对BMP家族的因子分泌能力，有明显的提升效果，这对于麝香酮促进BMSCs成骨能力，可能具有一定的意义［12］。

总的来讲，本课题采用麝香酮直接作用处理的方法，验证了其对大鼠BMSCs成骨能力的影响，初步证明了麝香酮对BMSCs的成骨能力和分化效果，均具有一定的促进作用，从而为BMSCs在骨损伤修复方面的应用提供了一种新的模式。但是，这种优化作用的深入机制，仍需要进一步的探索和研究。

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［12］Liu P，Feng Y，Dong C，et al.Administration of bmscs with muscone in rats with gentamicin－induced aki improves their therapeutic efficacy［J］.PloS one，2014，9（5）：e97123.

Effect analysis of muscone on the osteogenic potential of rat bone marrow derived mesenchymal stem cells

IU Min－jie，LIU Peng－fei，ZHAO Lei.
（Operating Theatre，Second Clinical Medical College of Jinan University，Shenzhen People’s Hospital，Shenzhen518020，China）

ObjectiveTo explore the effect of muscone on rat bone marrow－derived mesenchymal stem cells（BMSCs）and develop a novel strategy for the application of BMSCs on the restoration of bone injury.Methods BMSCs were isolated from rat bone marrow with density gradient centrifugation and the proliferation ability and special makers on cell surface were evaluated with CCK－8methods and FACS respectively.After being treated with muscone（1.0mg／L），the expression of osteogenic genes and the activity of alkaline phosphatase in BMSCs were further analyzed.Results The rat BMSCs could proliferate in vitro normally.The cells showed a positive expression of CD29，CD44and CD90，as well as a negative expression of CD45，which coincided with the normal phenotype.Besides，the results of real－time quantitative PCR indicated that the expression of some osteogenic genes，ALP，Collagen I，Runx2and Osterix，were upregulated in some degree，and the activity of alkaline phosphatase in BMSCs was also enhanced with the treatment of muscone.Conclusion In summary，muscone holds the promoter action on the osteogenic potential of rat BMSCs and application value in the restoration of bone injury with BMSCs.

bone marrow－derived mesenchymal stem cells；muscone；osteogenic differentiation

R392.2

A

2014－12－22）

1007－4287（2015）10－1618－04

深圳市知识创新计划（JCYJ20140416122812052）；深圳市卫生计生系统科研项目（201401010）

＊通讯作者