慢性丙型肝炎病毒感染患者血清IL-35表达水平及其意义

西安市第八医院肝病二科(西安710061)

尹 毅 贾元红△ 姚向波▲

慢性丙型肝炎病毒感染患者血清IL-35表达水平及其意义

西安市第八医院肝病二科(西安710061)

尹 毅 贾元红△姚向波▲

目的： 通过检测慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染者血清中白细胞介素-35(IL-35)的表达水平，探讨IL-35在HCV持续感染致病机制中的作用。方法： 用酶联免疫吸附试验(ELISA) 法检测263例慢性丙型肝炎患者和117例健康体检者的血清IL-35水平，并对不同临床诊断的HCV患者间的IL-35水平进行比较分析，同时分析IL-35与ALT、AST、TBIL、ALB和HCVRNA的相关性。结果： HCV感染者血清IL-35水平明显增高，高于健康对照者，其中HCV相关的肝癌IL-35水平最高3926.1(297.2～4129.1) pg/ml，明显高于肝硬化2497.1(117.2～3491.3)pg/ml 和慢性肝炎组1987.6(89.69～2987.3)pg/ml。结论： HCV感染者血清中IL-35水平明显升高，提示IL-35在HCV持续感染的免疫致病机制中起着一定作用，为临床诊断和治疗HCV感染提供了一种思路。

KEW WORDS Hepacivirus Interleukin -35/analysis Virus infections/physiopathology

慢性丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染发病机制和转归涉及感染、遗传、免疫等多个因素[1]。调节性T细胞(Regulatory T cells，Treg)能够下调机体天然免疫和获得性免疫反应，和HCV的慢性感染密切相关，它能抑制自身抗原和外来抗原引起的免疫应答，对抗感染免疫、抗肿瘤免疫反应均具有明显的抑制作用[2]。白细胞介素35(IL-35)的发现给免疫学在急慢性病毒感染发病机制及疾病预后带来新的指导意义，这种细胞因子是由Collison和Workman等科学家发现的，具有强大的免疫抑制作用。目前的研究发现IL-35具有调节Treg细胞分化的作用，在自身免疫性疾病的研究中越来越多，其能够抑制Th17细胞亚群的分化和增殖，同时对Th17细胞分泌的细胞因子产生抑制作用，对自身免疫性疾病过度的免疫反应具有抑制作用[3]。慢性HCV感染疾病进程中，不仅有Treg细胞的调节作用，Th17细胞也参与了疾病的进展和临床结局，IL-35作为这两种细胞的负性调节因子，目前的研究甚少，尤其是在慢性HCV感染的疾病进程中的作用。本文对HCV 感染者中慢性肝炎、丙型肝炎肝硬化和丙肝肝癌血清中 IL-35 表达水平进行分析，旨在探讨 IL-35 在 HCV 持续感染中的作用。

资料与方法

1 一般资料 选择2012年5月至2014年6月在我院就诊的慢性HCV 感染者263例，其中，男93例，女170例，平均年龄40.83±11.09岁。按照2000年病毒性肝炎防治方案的临床分类和诊断标准[4]和2001年全国肝癌学术会议通过的诊断标准，慢性丙型肝炎127例，HCV 相关肝硬化71例，HCV相关肝癌65例。肝硬化患者均无腹水，所有患者均排除合并有肾功能损害者以及合并其它慢性肝脏疾病(甲型、乙型、戊型病毒性肝炎，药物性肝炎，酒精性肝炎，自身免疫性肝炎，Wilson's病)和可引起高代谢的疾病(包括糖尿病, 获得性免疫缺陷综合征,甲状腺功能亢进)，均未进行干扰素抗病毒和免疫调节治疗。同时选择正常健康人117例作为对照，其中，男43例, 女74例，平均年龄39.78±1.19岁。研究对象均为中国陕西籍或长期居住在陕西地区的汉族人，且均为随机选择，无血缘关系，两组在年龄、性别方面无差异，具有可比性。

2 实验方法

2.1 标本的收集：入组患者清晨空腹无菌抽取静脉血分装2管，一管约2ml，用EDTA抗凝剂的试管收集，置于-30℃保存。另一管约3～5ml，用不加任何试剂的普通干燥管收集，然后离心10min(1000～2000转/min)，提取上层血清分装到干净的EP管中，置于-30℃冰箱中保存，备用。

2.2 IL-35 浓度的测定：采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)法。用抗人单抗IL-35包被于酶标板上，标准品和样品中的IL-35与单抗结合，加入生物素化的抗人IL-35，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，IL-35浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中IL-35浓度。每孔各加入标准品或待测样品100μl，将反应板充分混匀后置37℃60min。洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上印干。每孔中加入第一抗体工作液100μl。将反应板充分混匀后置37℃60min。再次洗板，每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30min。第三次洗板，每孔加入底物工作液100μl，置37 ℃暗处反应15min。每孔加入100μl终止液混匀，30min内用酶标仪在450nm处测吸光值。所有OD值都应减除空白值后再行计算。以标准品为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线，根据样品OD值在该曲线图上查出相应IL-35含量。ELISA试剂盒为美国Cusabio公司生产。

2.3 肝功能检查：肝功能ALT、AST、TBIL、ALB均采用全自动生化仪完成，HCV抗体由免疫实验室采用ELISA的方法进行测定，HCV RNA检测采用实时定量聚合酶链反应( Realtime-PCR) 技术由基因诊断室实验室完成。

2.4 统计学方法：选择SPSS 17.0统计学软件，研究人群群体的代表性，采用卡方检验和t检验进行比较；不同组间的细胞因子IL-35的比较，进行正态性检验，符合正态分布的两组间的比较采用t多组间的比较采用方差分析，进一步的两两比较采用LSD、SNK方法检验。P< 0.05为统计学有差异。

结 果

1 慢性HCV感染者和健康对照血清IL-35水平比较：慢性HCV感染者血清IL-35水平2972.63(89.69～4129.21) pg/ml明显高于健康对照组979.12(63.27～2341.12) pg/ml，差异具有统计学意义(P<0.001)。

2 慢性HCV感染不同临床诊断的血清IL-35水平比较：慢性HCV感染者中，127例慢性肝炎男性42例，女性85例，平均年龄39.21±10.12岁；71例HCV相关肝硬化男性21例，女性50例，平均年龄43.21±13.65岁；65例HCV相关肝癌男性28例，女性37例，平均年龄44.59±11.22岁，三组比较性别无差异(P﹥0.05)。因疾病进程的原因，肝癌患者多数比肝硬化和慢性肝炎发生晚，在年龄方面差异具有统计学意义(P<0.001)。HCV相关肝癌血清IL-35水平3926.1(297.2～4129.1) pg/ml明显高于肝硬化2497.1(117.2～3491.3) pg/ml和慢性肝炎1987.6(89.69～2987.3) pg/ml，差异具有统计学意义(P<0.001)，见附表。

附表 慢性HCV感染不同临床诊断 的血清IL-35水平比较

讨 论

由于疾病诊断技术和诊疗水平的提高，慢性HCV感染的发病率逐年升高，感染后不同免疫状态下，会出现不同的临床症状和表现，大多数都经历无症状期，慢性肝炎，肝硬化和肝细胞癌。慢性HCV感染过程中，有多种免疫细胞参与，细胞免疫和体液免疫均发挥着重要的作用，尤其是适应性免疫，其是体内被感染后，使机体产生抗感染能力。近年来，Treg细胞和Th17细胞在自身免疫性疾病和病毒感染性疾病中的研究越来越多，在慢性HCV感染中也有着重要作用，与疾病的进展和预后关系密切。在CD4+T细胞亚群中，Treg细胞是较为关键的细胞，其主要作用也是维持免疫耐受，防止自身免疫性疾病的发生，以及对慢性炎症性疾病具有一定的调节作用。在慢性HBV感染、哮喘、炎症性肠病改善炎症反应中的作用是不可估量的[4，5]。Treg/Th17细胞的平衡在慢性HCV感染中具体机制研究的还甚少，IL-35作为一种免疫抑制因子，不仅能够促进Treg细胞的分化，还能够抑制Th17细胞亚群的分化，在自身免疫疾病中过度免疫抑制中发挥着重要的作用[6]。然而IL-35在慢性HCV感染中的变化，尚未有具体的研究。越来越多的研究发现IL-35在感染性疾病中的重要性，不论是急性感染还是慢性感染，其均发挥着不容忽视的作用，在急性感染阶段，IL-35可诱导Th1细胞增殖来清除病原体，同时通过抑制Th17细胞分化来阻止过度的自身免疫反应，还可扩增Treg细胞，在随后的慢性感染阶段发挥抑制效应性T细胞作用，以阻止机体的免疫损伤，但Treg细胞在慢性丙型肝炎中的抑制作用很可能促进病毒的持续感染[7]。国外学者研究发现，不论是慢性HCV感染，还是自限性HCV感染，将中和抗IL-35抗体加入到Treg细胞和效应细胞共培养体系中，能够使Treg细胞介导的抑制效应失效，使免疫抑制作用减弱[8]。这项发现也预示着中和抗体IL-35的治疗作用，或者更进一步讲能够为临床中解决HCV持续、慢性感染问题带来希望。

这项研究对不同临床类型和疾病进程中的慢性HCV感染者血清的IL-35水平进行了比较分析，研究结果显示，慢性HCV感染者血清中IL-35水平2972.63(89.69～4129.21)pg/ml明显高于健康对照组979.12(63.27～2341.12) pg/ml，这也说明慢性HCV感染中IL-35的升高是免疫抑制的一种表现，同时我们对不同临床类型的慢性HCV感染者进行了分析，入组的不同临床诊断的患者中，比较慢性肝炎、肝硬化和HCV相关肝癌的肝功能时发现，血清ALT、AST、TBIL比较无差异。在一定程度上讲，ALT和AST受免疫系统调控，免疫系统中Th细胞间的平衡紊乱，同时也会伴随ALT和AST的异常。为了减少ALT和AST变化的影响，我们选择人群中基线水平相当的慢性HCV感染者，发现HCV相关肝癌组的血清IL-35水平明显高于肝硬化和慢性肝炎。肿瘤免疫与感染免疫的叠加，更加使得免疫抑制因子水平的升高，使得肿瘤逃逸，感染加剧。各项研究也支持我们的结果，IL-35在慢性HCV感染中发挥着作用，这种作用可能是通过其免疫抑制作用发挥的，其可以通过免疫调节机制，使得HCV与肝脏免疫细胞维持一种平衡，避免因为免疫反应对肝脏细胞和组织造成的严重病理损害。一旦慢性HCV感染后，疾病免疫反应发生变化，造成免疫紊乱和损害，IL-35又可以促进产生更多的免疫调节因子发挥其免疫调节的网络作用，这也是慢性HCV感染后肝细胞癌、肝硬化和慢性肝炎血清IL-35水平升高的一个原因。IL-35在自身免疫性疾病、感染性疾病以及肿瘤中的免疫调节作用，是一个复杂的网络结构。然而，这些疾病往往是因为各种原因导致正常的免疫系统调控出现异常，IL-35在该类疾病中的免疫调节作用也有着积极的意义，如果能够研究或者发现IL-35在慢性HCV感染不同临床分型和疾病进程中的免疫调节机制，就能够为慢性HCV感染的治疗带来希望。

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(收稿：2014-12-01)

IL-35 expression levers in serum and its significance in patients with chronic hepatitis C virus infection

The Eighth Hosprtal of Xi’an(Xi’an 710061)

Yin Yi Jia Yuanhong Yao Xiangbo

Objective：Through the detection of chronic hepatitis C virus (HCV) infection interleukin in serum vitamin -35 (IL-35) expression levels of IL-35 inpersistent HCV infection, to explore the pathogenesis mechanism. Methods：With the method of enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) method was used to detect the serum IL-35 level in 263 patients with chronic hepatitis C patients and 117 healthy, and the different clinical diagnosed HCV patients and the level of IL-35 were compared and analyzed, and the analysis of the IL-35 and the ALT, AST, TBIL, the correlation between ALB and HCVRNA. Results ：The serum IL-35 levels of HCV infection increased significantly, higher than that of healthy controls group, where HCV related hepatocellular carcinoma IL-35 highest level in 3926.1 (297.2～4129.1) pg/ml was significantly higher than that in liver cirrhosis, 2497.1(117.2～3491.3) pg/ml and chronic hepatitis B group was 1987.6(89.69～2987.3) pg/ml . Conclusion ：The level of serum IL-35 is significantly increased in conclusion HCV infection, suggesting that IL-35 plays a role in the immune pathogenesis of HCV persistent infection, and provides a new idea for clinical diagnosis and treatment of the treatment of HCV infection.

丙型肝炎病毒 白细胞介素-35/分析 病毒感染/病理生理学

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.03.010

△西安市卫生学校

▲西安市第八医院肝病三科