共表达NEP1-40和PRP-1多顺反子重组scAAV的构建*

西安交通大学医学院第一附属医院烧伤整形科 (西安 710061)

杨兴春 白转丽 王 瑞 柏宏亮▲

共表达NEP1-40和PRP-1多顺反子重组scAAV的构建*

西安交通大学医学院第一附属医院烧伤整形科 (西安 710061)

杨兴春 白转丽 王 瑞 柏宏亮▲

目的：构建共表达NEP1-40和PRP-1多顺反子重组双链腺相关病毒(scAAV)。方法：PCR扩增NEP1-40、PRP-1及FMDV2A的cDNA，建立NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1嵌合肽cDNA。两端加入Flag肽和6×His肽后合成融合基因cDNA，克隆到PES载体构建出重组质粒PES/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。双酶切重组质粒PBV220-NT4-NAP和 PES/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，连接得到重组质粒pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。以腺相关病毒pSS-CMV构建双链腺相关病毒穿梭质粒ssAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。经细胞内同源重组得到共表达NEP1-40和PRP-1的重组双链腺相关病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。测定病毒滴度并利用鸡胚背根神经节检测其生物活性。结果：克隆了共表达NEP1-40和PRP-1的多顺反子融合基因cDNA，基因测序及核苷酸序列同源性比较结果与设计序列一致；构建了重组质粒pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，酶切鉴定、核酸序列测定结果与理论值一致；重组的双链腺相关病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1应用于鸡胚背根神经节显示明显促进神经突起生长。 结论：成功构建了共表达NEP1-40和PRP-1的重组双链腺相关病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，并显示出促进鸡胚背根神经节神经突起生长作用。

近年来脊髓损伤的病理生理研究中取得了可喜的进展，人们对脊髓损伤后的病理变化和再生困难的认识也有了更深的理解，概括说是多种因素相互作用的结果，其中既有抑制神经突起的因素，也有促进神经再生缺乏的原因，是否能将多种影响脊髓功能恢复的因素结合在一起进行研究？在分析当前研究进展的基础上，本研究提出使用口蹄疫病毒的2A裂解点(FMDV 2A)构建多顺反子表达载体，通过自互补型腺相关病毒(Self-complementary AAV, scAAV)载体，同时表达富含脯氨酸的下丘脑-垂体神经保护肽(proline-rich peptide PRP-1)和中枢神经元轴突生长抑制蛋白质Nogo的受体拮抗剂(NEP1-40)，试图通过促进脊髓神经再生和阻抑神经突起再生蛋白受体(NgR)的双向作用，为脊髓损伤临床治疗寻找可行的方法。

材料与方法

1 质粒与试剂 重组质粒PBV220-NT4-NAP质粒由杨宇博士惠赠，限制性内切酶NaeⅠ、EcoRⅠ、Bam HI、Taq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶等购自华美生物工程公司。人胚肾293细胞系、大肠杆菌E.Coli DH5α及载体质粒PES、pBV220-NT4 质粒、辅助质粒pAAV-Ad，腺相关病毒穿梭质粒pSSHG-CMV均由西安华广生物工程公司提供。引物合成及测序由上海生物公司完成。

2 方 法

2.1 共表达NEP1-40和PRP-1与多顺反子FMDV 2A融合基因cDNA克隆及序列分析

2.1.1 神经肽PRP-1的cDNA克隆:由GenBank获得PRP-1的氨基酸序列，在其氨基端加装SRR前蛋白转变酶识别序列AGC CGG CGT，创建Nae I的内切酶识别位点。然后按照哺乳动物适宜密码子原则合成cDNA，在cDNA的3`-端加TGA终止密码子适宜的酶切点(图1)。将合成的cDNA克隆到PES载体，测序正确后用Nae I和BamHI双酶切回收PRP-1的cDNA。

图1 合成的PRP-1 cDNA结构

2.1.2 神经肽NEP1-40的cDNA克隆：从GenBank获得大鼠Nogo-66 cDNA序列，设计正反向引物，在正向引物的5`-端加入编码SRR的AGC CGG CGT酶识别点，同时也是前蛋白转变酶识别点序列，RT-PCR扩增得到编码SRR的NEP1-40 cDNA。然后将其克隆到PES载体，测序正确后用Nae I和BamHI双酶切回收NEP1-40的cDNA。

2.1.3 等分子数共表达NEP1-40和PRP-1的多顺反子FMDV 2A的cDNA克隆：从数据库获得了FMDV 2A的氨基酸序列，按照哺乳动物适宜密码子原则合成编码FMDV2A的cDNA。再重新合成NEP1-40的反向引物，新引物删除TGA终止子和BamHI酶识别位点，使用正反引物并以建立的NEP1-40质粒为模板，扩增得到删除了终止子的NEP1-40的cDNA。再根据FMDV2A的cDNA和删除了终止子的NEP1-40的cDNA序列，合成Overlap PCR引物，使用Overlap PCR原理，扩增得到NEP1-40-FMDV 2A嵌合cDNA。再将已经建立的PRP-1 cDNA用相同的方法嵌合到NEP1-40-FMDV 2A的下游，建立NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1嵌合肽cDNA结构(图2)。然后将其克隆到PES载体，测序正确后用Nae I和BamHI 双酶切回收嵌合肽cDNA。

图2 NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1嵌合肽cDNA结构示意图

2.1.4 融合基因cDNA克隆：在嵌合肽NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1的cDNA结构的两端分别加入Flag标签肽和6×His肽的cDNA序列后得到融合基因cDNA。将其克隆到PES载体，构建出含有融合基因NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1的重组质粒PES/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1(图3)，测序正确后用NaeI和BamHI双酶切回收融合基因cDNA,交公司测序。

图3 重组质粒PES/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1图谱

2.2 融合基因表达盒的构建策略：重组质粒PBV220-NT4-NAP经限制性内切酶NaeⅠ与BamHⅠ联合消化后，弃掉NAP，用1%琼脂糖凝胶电泳法回收PBV220-NT4基因片段。同样方法经NaeⅠ与BamHI联合消化PES/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，回收融合基因NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1片段。T4DNA连接酶连接两片段，得到融合基因表达盒重组质粒pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1(图4)。

图4 融合基因表达盒重组质粒 pBV220-NT4 /NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1构建图

2.3 重组质粒pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1的酶切鉴定及核酸序列测定：按照参考文献[1]方法进行测定。

2.4 构建单链腺相关病毒穿梭质粒ssAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1：碱裂解法大量制备已构建重组质粒pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，用EcoRⅠ和BamHI酶切腺相关病毒pSS-CMV和pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，T4 DNA连接酶连接后转化感受态细菌E.Coli DH5α菌株，提取质粒，酶切筛选并鉴定阳性克隆，用EcoRⅠ和BamHI酶切鉴定，筛选的单链AAV重组子命名为pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。

2.5 构建双链腺相关病毒穿梭质粒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1：T4连接酶分别连接NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 cDNA 、线性化的scAAV 载体和△ITR-polyA3个片段，获得分泌表达NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1的重组质粒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，提取质粒，酶切筛选并鉴定阳性克隆，用EcoRⅠ和BamHI双酶切鉴定。

2.6 重组双链腺相关病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1的包装及滴度测定：重组质粒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1、辅助质粒pAAV-Ad、腺病毒全基因组质粒pFG140三质粒磷酸钙共沉淀法转染293细胞，筛选阳性转化细胞，收获并纯化重组病毒，收获的毒种感染293细胞，离心取上清，-20℃保存，浓缩的病毒使用Dig-GFP 探针斑点杂交法测定滴度。对重组病毒DNA进行PCR扩增、电泳测试。

2.7 生物活性测定：显微解剖镜下分离、摘取8d 鸡胚背根神经节(SC-DRG)，将其分散接种于涂布了多聚赖氨酸的平皿内，加入培养基，浸没神经节。CO2孵箱内，37℃封闭培养12 h 后，分别加入回收的融合基因表达蛋白0.1μl(实验组)和等量的培养液(对照组)，继续培养24h，相差倒置显微镜下观察神经节生长情况。

结 果

1 共表达NEP1-40和PRP-1的多顺反子FMDV 2A融合基因测序及核苷酸序列同源性比较：对合成的共表达NEP1-40和PRP-1的多顺反子FMDV 2A融合基因序列进行测定。测序结果与设计序列完全一致。融合基因核苷酸克隆序列与设计的基因核苷酸序列一致。

2 共表达NEP1-40和PRP-1的多顺反子FMDV 2A融合基因表达盒的鉴定

2.1 共表达NEP1-40和PRP-1的多顺反子FMDV 2A融合基因表达盒的酶切鉴定：重组质粒 pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1经NaeⅠ与BamHⅠ联合消化后，1%琼脂糖凝胶电泳，产生3.852kb和0.48kb两个片段，与理论值完全一致(图5)。

A:未经酶切的重组质粒pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1;B:经NaeⅠ与BamHI双酶切后的片段;C:DNA 标尺(单位bp)

图5 融合基因表达盒重组质粒

pBV220-NT4/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1电泳图

2.2 共表达NEP1-40和PRP-1的多顺反子FMDV 2A融合基因表达盒的核酸序列测定：对电泳回收的重组融合质粒pBV220-NT4/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1插入片段进行核酸序列测定，与设计的序列完全一致，说明插入片段为融合基因。

3 单/双链腺相关病毒穿梭质粒ssAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1鉴定：两个腺相关病毒穿梭质粒酶切后均获得了与预期相符480bp条带。

4 重组双链腺相关病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1的鉴定与滴度测定：对重组病毒DNA进行PCR扩增、电泳测定，产生3.852kb和0.48kb两个片段，与理论值完全一致(图6)。Dig-GFP 探针斑点杂交法测定滴度3.2×1010pfu/ml，表明构建的重组双链腺相关病毒具有高滴度活性和病毒感染效应。

5 生物活性鉴定：实验组中鸡胚背根神经节组织周缘有神经突起呈放射状长出(图7A)。对照组未见神经突起长出(图7B)。证实融合基因NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1在原核细胞中得到了正确表达和翻译后加工，具有促进鸡胚背根神经节轴突生长能力。

A:DNA 标尺(单位bp);B:经NaeⅠ与BamHⅠ双酶切后的片段;C:未经酶切的重组质粒pSSCMV-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1

图6 pSSCMV-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1质粒鉴定电泳图

A :鸡胚背根神经节组织培养法检查原核表达的生物学活性，加入表达产物24h后，鸡胚背根神经节组织周缘有大量神经突起呈放射状长处(×20，倒置相差显微镜);B:对照组未见神经突起长出(×20，倒置相差显微镜)

图7 生物活性鉴定图

讨 论

脊髓损伤后功能恢复的研究一直是医学研究的热点。众多研究表明，目前所使用的方法还需要进一步的改进和加强，才有可能实现脊髓损伤后的机能重建。在分析当前研究进展的基础上，本研究提出使用猪口蹄疫病毒2A裂解子(FMDV 2A)构建多顺反子的自互补型腺相关病毒(scAAV)，目的是同时等分子数地表达脊髓神经的突出再生促进肽(PRP-1)和阻断内源突出再生抑制蛋白的生物活性肽(NEP1-40)，通过双作用机制来实现损伤脊髓的组织和机能重建。

Nogo是来自神经鞘的突出生长抑制因子[2]，对神经细胞突出再生具有的明显抑制。NEP1-40是Nogo受体(NgR)的竞争性拮抗剂。脊髓损伤后寡突胶质细胞表面脱落的Nogo作用于NR来发挥作用。敲除NR的动物和使用抗NR抗体可以解除神经突出的生长抑制，脊髓和外周神经损伤后的突出再生可以大大加强[2]。Hanell A等报告NEP1-40能够和NR结合，竟争性抑制Nogo-66的突出再生抑制作用[3]。研究者[4,5]局部使用合成的NEP1-40治疗大鼠中段脊髓背侧半切，几天后见到明显的突出再生和机能恢复。

富含脯氨酸多肽(PRP)是一组富含脯氨酸的具有神经保护功能的短肽类细胞因子[6]。Galoyan每日给坐骨神经横断和脊髓横断的大鼠肌肉注射10μg/100g的PRP-1，3周后有组织学的恢复和机能改善[7]，而且PRP-1能够治疗钝挫伤引起的脊髓和脑神经变性。提示PRP-1在损伤和退行性脑及脊髓损伤的治疗中有巨大潜在应用价值。

FMDA 2A裂解因子是口蹄疫病毒( FMDV)的多聚前体蛋白在2A 的羧基端存在的一小段自裂解序列[8]，其多肽序列中含有一个高度保守的基序，并在2A起始剪切中起到关键作用。FMDV 2A的剪切活力达100%，且FMDV 2A基因的选择与上下游顺序对其剪切活性基本没有影响。使用FMDV 2A可以方便的构建多顺反自子表达载体，能同时表达两种以上的目的蛋白或目的肽。本研究选用FMDV 2A裂解子构建多顺反子表达载体，目的使获得上下游神经保护肽NEP1-40和PRPs都能得到有效的表达[9]。这种同时表达多种神经再生和营养因子的双靶向双基因治疗策略(Dual-Targeting Dual Gene-Virotherapy)，有利于在脊髓损伤的基因治疗中产生更好的效果。

自互补型腺相关病毒(scAAV)是近年来重组AAV的重要改进[10]。scAAV进入细胞后可以直接表达，不需要由单链变为双链的过程，而且表达水平相对较高，非常适于在要求目的基因快速表达且需要较高表达水平的基因治疗方案中[11]。scAAV的缺点是包装容量的进一步减低，通常不能超越2.1kb[12]。本研究目的cDNA片段短小，构建的表达盒能够满足scAAV的包装要求。

本实验成功克隆了共表达NEP1-40和PRP-1的多顺反子FMDV 2A融合基因cDNA，经对其进行基因测序及核苷酸序列同源性比较，显示克隆序列与设计序列完全一致。将共表达NEP1-40和PRP-1的多顺反子FMDV 2A融合全基因与NT4的信号肽连接，构建了融合基因表达盒pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，经酶切鉴定、核酸序列测定和编码区编码氨基酸序列推导，结果显示与理论值完全一致。通过腺相关病毒pSS-CMV先后构建单/双链腺相关病毒穿梭质粒ssAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1，电泳酶切产物显示与预期大小一致的片段。通过共转染技术、经细胞内同源重组、包装后得到共表达NEP1-40和PRP-1的重组双链腺相关病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1。测定重组双链腺相关病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1病毒滴度也显示具有高滴度活性和病毒感染效应。将其应用于体外培养的鸡胚背根神经节，表达蛋白组中有大量神经突起向组织块外四周呈放射状长出，而单纯培养液组未见明显神经突起长出。表明构建的共表达NEP1-40和PRP-1的重组双链腺相关病毒scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1在原核细胞中得到了正确表达和翻译后加工，产生并分泌了具有生物学活性蛋白，这将为今后进行的动物实验奠定了基础，并为脊髓损伤的基因治疗提供了新的思路。

[1] 萨姆布鲁克,拉塞尔(美)著,黄培堂 主译. 分子克隆实验指南[M].北京: 化学工业出版社,2007: 405-436.

[2] Gonzenbach RR, Gasser P, Zorner B,etal. Nogo-A antibodies and training reduce muscle spasms in spinal cord-injured rats. Ann Neurol,2010,68(1):48-57.

[3] Hanell A, Clausen F, Bjork M,etal. Genetic deletion and pharmacological inhibition of Nogo-66 receptor impairs cognitive outcome after traumatic brain injury in mice[J]. J Neurotrauma,2010,27(7):1297-1309.

[4] Suehiro K, Nakamura Y, Xu S,etal. Ecto-domain phosphorylation promotes functional recovery from spinal cord injury[J]. Sci Rep,2014,15(4):4972-4981.

[5] Zhilai Z, Hui Z, Yinhai C,etal. Combination of NEP 1-40 infusion and bone marrow-derived neurospheres transplantation inhibit glial scar formation and promote functional recovery after rat spinal cord injury[J].Neurol India,2011,59(4):579-585.

[6] Galoyan AA, Krieglstein J, Klumpp S,etal. Effect of hypothalamic proline-rich peptide (PRP-1) on neuronal and bone marrow cell apoptosis[J]. Neurochem Res,2007,32(11):1898-1905.

[7] Armen A, Galoyan D, John S,etal. Neuroprotective action of hypothalamic peptide PRP-1 at various time survivals following spinal cord hemisection[J]. Neurochemical Research, 2005,30:507-525.

[8] Goodwin S, Tuthill TJ, Arias A,etal. Foot-and-mouth disease virus assembly: processing of recombinant capsid precursor by exogenous protease induces self-assembly of pentamers in vitro in a myristoylation-dependent manner[J]. J Virol,2009,83(21):11275-11282.

[9] Cao Y, Sun P, Fu Y,etal. Formation of virus-like particles from O-type foot-and-mouth disease virus in insect cells using codon-optimized synthetic genes[J].Biotechnol Lett,2010,32(9):1223-1229.

[10] Hollis Ii ER, Kadoya K, Hirsch M,etal. Efficient retrograde neuronal transduction utilizing self-complementary AAV[J].Mol Ther,2008,16(2):296-301.

[11] 王俊红,王 枫,董 鹏,等. 双链腺相关病毒介导表达Exendin-4治疗糖尿病大鼠的研究[J]. 第三军医大学学报,2013,35(17): 1831-1835.

[12] Wu Z, Sun J, Zhang T,etal. Optimization of self-complementary AAV vectors for liver-directed expression results in sustained correction of hemophilia B at low vector dose[J]. Mol Ther, 2008,16(2):280-289.

(收稿：2014-12-15)

Construction of Multicistronic scAAV containing the FMDV 2A cleavage actor and co-expressing NEP1-40 and PRP-1 Burn & Plastic Department of the First Affiliated Hospital of Medical School of

Xi’an Jiaotong University (Xi’an 700061)

Yang Xingchun Bai Zhuanli Wang Rui et al

Objective: To construct the multicistronic scAAV containing the FMDV 2A cleavage factor and co-expressing NEP1-40 and PRP-1. Methods: PCR technology was used to amplify the NEP1-40, PRP-1 and FMDV2A cDNA. The chimeric peptide cDNA containing NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 was set up. Then the fusion gene cDNA was synthetized after adding the Flag peptides and 6×His peptides at ends. The recombinant plasmid PES/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 was constructed by cloning the fusion gene into the PES vector. The recombinant plasmid pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 was obtained after digesting and connecting the plasmid PBV220-NT4-NAP and PES/ NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1. The double-stranded AAV shuttle plasmid ssAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 was constructed basing on the AAV pSS-CMV. Finally the recombinant scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 was obtained by homologous recombination in cells. The titer of the recombinant scAAV was measured and its biological activity was detected in the chicken embryo dorsal root ganglion (EDRG). Results: The fusion gene cDNA for co-expressing NEP1-40 and PRP-1 was cloned. The gene sequencing and nucleotide sequence homology comparison show consistent with the design sequence. The recombinant plasmid pBV220-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 was constructed and the results of enzyme identification and the nucleic acid sequence were consistent with the theoretical value. The growth of neural processes showed obviously after using the recombinant scAAV in chicken EDRG. Conclusion: The recombinant scAAV pSSHG-NT4 / NEP1-40-FMDV 2A-PRP-1 is constructed successfully and displays promoting role in the chicken EDRG.

@Proline-rich peptide PRP-1 @NEP1-40 Foot and mouth disease virus @Multicistronic vector @Self-complementary AAV

*陕西省科技研究发展(攻关)计划项目(2011K12-12)

@富含脯氨酸多肽 @NEP1-40 口蹄疫病毒 @多顺反子载体 @自互补型腺相关病毒

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.03.002

▲通讯作者