HPLC同时测定甘肃不同产地黄芩及不同炮制品中黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素的含量*

2015-05-04杨志军杨秀娟耿广琴

中医研究 2015年9期

关键词：量瓶炮制黄芩

杨志军,杨秀娟,耿广琴,李晶,邓毅

(甘肃中医药大学，甘肃兰州 730000)

·药学研究·

HPLC同时测定甘肃不同产地黄芩及不同炮制品中黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素的含量*

杨志军,杨秀娟,耿广琴,李晶,邓毅

(甘肃中医药大学，甘肃兰州 730000)

目的:建立反相高效液相色谱法同时测定甘肃不同产地黄芩及不同炮制品中黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素的含量。方法：采用Phecda C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，以甲醇-2 g/L冰醋酸溶液为流动相，梯度洗脱,检测波长为278 nm,流速1.0 mL/min,进样量10 μL,柱温30 ℃。结果：黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的线性范围分别为0.06～9.00 μg(r=0.999 9)，0.001 0～0.300 0 μg(r=0.999 9)，0.001 05～0.315 0 μg(r=0.999 96)，黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的平均回收率分别为102.77% (RSD=3.64%)，98.75% (RSD=1.31%)，96.90%(RSD=1.84%)。结论：本法操作简便、快捷、结果准确、可用于黄芩的质量控制。

黄芩；高效液相色谱法；黄芩苷；黄芩素；汉黄芩素;含量测定；炮制；甘肃

黄芩为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，是我国的传统中药，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效[1]。现代研究显示其具有抗心律失常、抑菌、抗癌等作用[2-3]。黄芩的主要活性成分有黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等，不同炮制方法对其含量亦有影响[4-5]。黄芩虽非甘肃道地药材，但由于近年来栽培面积大、产量高，临床疗效好，已被确定为甘肃“十大陇药”之一。本研究拟采用高效液相色谱法建立同时测定甘肃陇西、岷县、漳县及渭源4个代表产区黄芩中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素3种主要成分的方法，并分别测定4个产地的生黄芩、酒黄芩和黄芩炭中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量，以探讨并比较甘肃不同产区黄芩及其不同炮制品的质量差异，并为下一步进行甘肃不同产区黄芩的药效研究提供实验数据，也为更好地开发、利用甘肃资源打下坚实的基础。

1 材料

1.1 药品、试剂与仪器

黄芩于2014年11月初采自甘肃省陇西县文峰镇(1100)、陇西县首阳镇(1101)、岷县(1102)、渭源县(1103)、漳县(1104)，均为两年生植物，按采集次序依次编号为1100-1104，经甘肃中医药大学药学院杜弢教授鉴定为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根。甲醇为色谱纯，磷酸等其他试剂均为分析纯，购自天津市富宇精细化工有限公司，黄芩苷对照品(批号10715-201117)、黄芩素对照品(批号111595-201306)、汉黄芩素对照品(批号111514-200403)，均购自中国药品生物制品检定所。Agilent 1260高效液相色谱仪(DAD检测器，四元泵)，美国Agilent公司产品；Phecda C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Hanbon Sci. & Tech.公司产品；AL104电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司产品；HH-S恒温水浴锅，金坛市大地自动化仪器厂产品；KQ-250超声清洗仪，昆山市超声仪器有限公司产品；SFG-02B电热恒温鼓风干燥箱，黄石市恒丰医疗器械有限公司产品。

1.2 炮制品制备

生品黄芩的制备：取黄芩，除去杂质，置沸水中煮10 min，取出，焖透，切薄片，干燥。酒制黄芩的制备：将黄芩以温水泡1 h，加酒拌匀，蒸至上气时取出，切片，干燥(每100 kg黄芩，用酒12.5 kg)。炒炭黄芩的制备：取黄芩片，置锅内用武火加热，炒至黑褐色时，喷淋清水少许，灭尽火星，取出，晾透。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Phecda C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为20 mL/L冰醋酸溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脱(0-25 min，50%～25%A；25-30 min，25%～50%A)，柱温30 ℃，波长277 nm，进样量10 μL，流速1 mL/min。

2.2 混合对照品溶液的制备

精密称取黄芩苷6.00 mg、黄芩素 5.00 mg、汉黄芩素对照品 5.25 mg，分别置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得质量分数为 600,500，525 mg/L的黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素对照品贮备液。精密吸取黄芩苷对照品溶液1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得质量分数为60 mg/L的黄芩苷对照品稀释液；再精密吸取黄芩素及汉黄芩素对照品溶液各1 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得质量分数分别为20， 21 mg/L 的黄芩素和汉黄芩素混合对照品溶液A；再精密吸取黄芩素及汉黄芩素混合对照品溶液各0.5 mL，置10 mL量瓶中，即得质量分数为1.00，1.05 mg/L的黄芩素和汉黄芩素混合对照品溶液B。精密量取质量分数为600 mg/L的黄芩苷贮备液及质量分数分别为20,21 mg/L的黄芩素和汉黄芩素对照品混合溶液各1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素含量分别为60，2.0，2.1 mg/L的溶液，作为混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取黄芩药材粉末(过四号筛)约0.3 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加入700 mL/L乙醇40 mL，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)30 min，放冷，滤过；滤液置100 mL量瓶中，加700 mL/L乙醇分次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加700 mL/L乙醇至刻度，摇匀；精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液10 μL注入液相色谱仪。

2.4 线性考察

分别精密吸取2.2项下质量分数为600 mg/L的黄芩苷对照品贮备液①2.5，5，10，15 μL和质量分数为60 mg/L的黄芩苷对照品稀释液②1，2.5，5，10 μL，注入液相色谱仪，测得峰面积，再分别精密吸取2.2项下的黄芩素和汉黄芩素混合对照品溶液A 1，2.5，5，10，15 μL和混合对照品溶液B 1，2.5，5，10 μL，分别以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归。结果表明：黄芩苷在0.06～9.00 μg范围内线性关系良好，回归方程为Y=3 512.4X-115.4(r=0.999 9)；黄芩素在0.001 0～0.300 0 μg范围内线性关系良好，回归方程为Y=5 406.6X+0.062 2(r=0.999 9)；汉黄芩素在0.001 05～0.315 0 μg范围内线性关系良好，回归方程为Y=6 047.6X+2.021 1(r=0.999 96)。

2.5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，测得黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的峰面积RSD值分别为0.48%、0.40%和0.52%。结果表明：仪器具有良好的精密度。

2.6 重复性试验

分别精密称取同一批药材，按2.3 项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定。结果:黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的平均含量分别为153.44,4.54,1.49 mg/g，RSD分别为2.60%、3.18%、3.08%(n=6)。结果表明：重复性较好。色谱图见图1。

1.黄芩苷; 2.黄芩素;3.汉黄芩素;A.对照品;B.黄芩样品图1 黄芩含量测定HPLC色谱图

2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，室温放置，并分别于0，2，4，6，8，10，12，24 h进样测定。结果：3种待测黄酮峰面积的RSD分别为黄芩苷0.29%，黄芩素0.78%，汉黄芩素1.54%。结果表明：供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素含量分别为153.44，4.54，1.49 mg/g的黄芩药材6份，每份约0.15 g，加入黄芩苷对照品约22 mg，精密称定，精密加入黄芩素对照品溶液(500 mg/L) 1.4 mL、汉黄芩素对照品溶液(525 mg/L)0.45 mL，以下按2.3方法制备加样回收供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定。结果见表1。

2.9 含量测定

鉴于岷县酒制品、渭源酒制品中汉黄芩素的含量及岷县炒炭品中黄芩苷的含量过低，故在2.3项下供试品溶液的制备方法基础上，将最后一步改为精密量取1 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。其余样品按2.3项下方法制备。按选定的色谱条件对甘肃不同产地及不同炮制品的黄芩中黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素进行测定，每批平行3次，含量测定结果见表2。

表1 加样回收率试验结果 n=6

表2 甘肃不同产地及不同炮制品黄芩中黄芩苷、黄芩素与汉黄芩素含量测定 n=3

3 讨论

目前2010版《中国药典》一部黄芩项下仅以黄芩苷的含量测定方法为标准，而黄芩苷在内源酶催化水解作用下会产生大量黄芩素[7]；因此仅以黄芩苷作为指标不能全面评价黄芩药材的质量。本实验采用HPLC建立同时测定甘肃黄芩中黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素含量的测定方法，为全面衡量及综合评价黄芩药材质量提供了参考。

在色谱条件的考察过程中，我们对检测波长、流动相组成、样品提取方式、提取溶剂及提取时间做了考察，经HPLC-DAD检测器全波长扫描，黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素在波长277 nm处有最大吸收，与文献报道[8-10]基本一致。通过考察甲醇及700 mL/L乙醇两种溶媒及提取时间30 min、45 min、1 h、3 h，优化出最佳提取条件为黄芩用700 mL/L乙醇超声处理30 min。本实验以甘肃省黄芩产量较大的陇西、漳县、渭源及岷县4个产区的黄芩为研究对象进行黄芩苷、黄芩素及汉黄芩素3种成分的含量比较，结果：4个产地生品黄芩中黄芩苷含量均符合2010版《中国药典》一部饮片标准，不同产地黄芩生品中黄芩苷含量由高到低依次为漳县>渭源>陇西>岷县，黄芩素含量由高到低依次为陇西>漳县>渭源>岷县，汉黄芩素含量由高到低依次为漳县>渭源>岷县>陇西。结果显示：不同产地的黄芩中黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素含量存在一定差异。黄芩的炮制方法很多，现代炮制中最常用的方法为蒸法、酒法及炒炭。本研究用以上3种炮制方法对4个产区的黄芩进行炮制，以不同产区中3种成分含量最高陇西进行比较，结果：黄芩苷的含量由高到低依次为生品黄芩>酒制黄芩>炒炭黄芩，黄芩素和汉黄芩素的含量由高到低依次为炒炭黄芩>生品黄芩、酒制黄芩。此与黄芩炒炭后黄芩苷的含量下降、黄芩素与汉黄芩素的含量显著升高的文献报道[11]一致，提示炒炭后黄芩由于受到局部高热会导致黄芩苷等黄酮苷分解破坏，可转化成苷元。

本研究采用HPLC测定黄芩的3种主要成分，确定甘肃最佳的黄芩产区及最佳的炮制方法，为下一步进行甘肃产黄芩的药效研究及有效成分的提取打下了坚实基础。

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