超高效液相色谱法测定氯氮平有关物质

2020-07-15邱荣荣朱娟孙洁常州制药厂有限公司江苏常州213000

化工管理 2020年18期

邱荣荣朱娟孙洁（常州制药厂有限公司，江苏常州213000）

0 引言

氯氮平对精神分裂症的阳性或阴性症状具有较好的疗效，被称为“全新的第四代抗精神病药”，属于我国基本药物。各国药典[1-3]均有收载，而我国现行药典仅用HPLC自身对照法控制杂质总量，缺少对特殊杂质研究，而国外药典均已明确控制相关的特殊杂质。在前期研究过程[1-7]中发现，各国药典检测方法都不能很好分离本论文确定已知杂质和特殊未知杂质，且分析时间较长、分离度较差问题。查阅文献结合检验效率要求，开发了超高效液相色谱法(UPLC)测定氯氮平有关物质检验方法。文章建立UPLC 法操作简单准确测定氯氮平中各杂质，可用于氯氮平有关物质质量控制。

1 仪器与试药

Waters超高压液相色谱仪、Empower3软件；梅特勒-托利多XPE205 电子天平、FE20 pH 计。氯氮平原料药(常州制药厂有限公司，批号190730）；氯氮平对照品(中检所，批号100323-201102)；杂质A,B,C,D,E,5(常州制药厂有限公司)；甲醇为色谱纯；磷酸二氢钾、磷酸为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Rapid Resolution HD (2.1 mm×150mm 1.8μm)；；流速：0.35 mL·min-1；检测波长：257 nm；柱温：35℃；进样量：2μl；以2‰磷酸二氢钾水溶液(pH2.4)：甲醇(75：25)为流动相(A)；以2‰磷酸二氢钾水溶液(pH2.4)：甲醇(10：90)为流动相(B)；以甲醇：水(80：20)为稀释液；进行0～2分流动相(A)100%、2～13分流动相(A)100%至0%、13～15分流动相(B)100%梯度洗脱。

2.2 溶液的制备

称取杂质A,B,C,D,E,5 对照品各7.5mg 于100ml 量瓶中，加80ml 甲醇溶解并加水稀释至刻度，摇匀；称取氯氮平对照品75mg 于100ml 量瓶中，加80ml 甲醇溶解，移取上述溶液5ml 于同一100ml 量瓶中，加水定容，摇匀作为系统适用性溶液；称取本品75mg 于100ml 量瓶中，加80ml 甲醇溶解并用水稀释至刻度，摇匀作为供试品溶液；移取1ml 供试品溶液置100ml 量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，再移取5ml 于50ml 量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀作为对照溶液。

2.3 专属性试验

取系统适用性溶液照“2.1”项色谱条件进样分析，系统适性图谱(见图1.)。结果表明，氯氮平与各杂质峰均能达到良好的分离，分离度可达到4.0以上。

2.4 降解试验

称取本品75mg 共9 份，分别置于100ml 量瓶中，分别进行酸破坏(加5ml 的0.1mol·L-1 盐酸溶液，放置4 小时，加0.1mol·L-1 氢氧化钠溶液5ml 调pH 至中性)、碱破坏(加5ml 的0.1mol·L-1 氢氧化钠溶液，放置10 分钟，加0.1mol·L-1 盐酸溶液5ml调pH至中性)、氧化破坏(加4ml 10%双氧水于60℃水浴放置10分钟)、光照破坏(置于4500LUX±500LUX 光照12 天)、高温破坏(置于105℃放置4 小时)、高湿破坏(置RH92.5%放置12 天)和未破坏均加80ml甲醇溶解并用水稀释至刻度，摇匀作为供试品溶液。照“2.1”项下色谱条件测定上述溶液，降解试验结果表明，氯氮平主峰及各杂质峰(降解杂质峰)均能达到良好的分离，峰纯度均符合要求(峰纯度阈值大于峰纯度角值)，且质量保持平衡，氧化加热破坏下杂质A和E增大较大，其它破坏影响较小。说明本方法专属性好，能够有效检测样品中的降解产物。

2.5 线性及校正因子

称取氯氮平及杂质A,B,C,D,E,5 对照品各15mg 置同一200ml量瓶中加160ml甲醇溶解并用水稀释至刻度，摇匀，分别移取0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml 置100ml 量瓶稀释液溶解稀释至刻度摇匀作为线性溶液。照“2.1”项下色谱条件测定上述溶液，由浓度(μg/ml)对峰面积做线性回归方程及校正因子，线性方程分别为Y=19917.7X+313.8、Y=23587.2X-9.8、Y=19655.2X-220.3、 Y=16986.8X+142.5、 Y=7371.9X+63.7、 Y=13021.3X+9.6、Y=8223.1X+20.5；相关系数均大于0.9995在相应浓度范围内线性良好；校正因子分别为0.8、1.0、1.2、2.7、1.5、2.4。

2.6 回收率试验

图1 系统适用性图谱Fig.1Chromatogram of system suitability

称取杂质A,B,C,D,E,5 对照品各15mg 置同一200ml 量瓶中加160ml 甲醇溶解并用水稀释至刻度，摇匀作为回收率杂质贮备液。称取氯氮平样品75mg共12份，分别置于100ml量瓶中，分别移取0.5、1.5、3.0ml 回收率杂质贮备液各3 份加80ml 甲醇溶解并用水稀释至刻度，摇匀作为回收率供试品溶液。照“2.1”项下色谱条件测定上述12 份溶液，计算各杂质回收率分别为97.8%、102.8%、107.4%、92.3%、104.1%、103.7%和RSD 分别为1.2%、1.4%、1.4%、8.1%、1.0%、1.2%。表明本方法杂质回收率良好。

2.7 检测限和定量限

称取氯氮平及杂质A,B,C,D,E,5 对照品各7.5mg 分别置100ml量瓶中加80ml甲醇溶解并用水稀释至刻度，摇匀，移取相应溶液适量，用稀释液逐级稀释，照“2.1”项下色谱条件进样分析，按信噪比S/N=10 计算定量限0.11、0.03、0.13、0.11、0.28、0.12、0.11μg.ml-1，均低于相当于主成份0.05%限度水平，且连续6 针峰面积RSD 均小于5.0%；按信噪比S/N=3 计算检测限分别为0.03、0.01、0.04、0.03、0.08、0.04、0.03μg.ml-1均低于相当于主成品0.01%限度水平。

2.8 精密度试验

照“2.1”项下色谱条件，连续测定对照溶液6 针，主峰峰面积RSD小于1.0%，表明本法精密度良好。

2.9 重复性试验

称取氯氮平样品75mg 6 份，分别置于100ml 量瓶中，分别移取1.5ml 回收率杂质贮备液(相当于主成份0.15%)加80ml 甲醇溶解并用水稀释至刻度，摇匀作为重复性试验溶液，照“2.1”项下色谱条件，连续测定上述6份溶液，计算6份溶液中各杂质含量RSD均小于5.0%，表明本法精密度良好

2.10 耐用性考察

根据“2.1”项下色谱条件，分别改变柱温(33、37℃)、流速(0.33、0.37ml/min)、波长(255、259nm)、pH(2.35、2.45)、流动相A两相比例(74：26、76：24)和流动相B两相比例(9：91、11：89)进行系统适应性溶液试验，结果表明上述色谱条件下，氯氮平与各杂质峰间均能达到较好分离，其参数的微小变化不影响检测，表明本方法耐用性较好。