跑台运动对慢性应激抑郁大鼠行为学及海马CA1、CA3 区NGF表达的影响

于芳 崔建梅 薄媛媛 张安民

摘要：为观察4周跑台运动对慢性不可预知性应激（CUS）致抑郁大鼠行为学、血浆促肾上腺皮质激素（ACTH）及皮质醇（CORT）含量、海马CA1、CA3区NGF表达的影响，将30只SD大鼠随机分为对照组、应激模型组及应激运动组，大鼠建立慢性不可预见性应激抑郁模型，同时应激运动组大鼠进行4周跑台运动。运动及应激结束后通过旷场实验、悬尾实验方法评定大鼠行为学指标变化情况，采用八臂迷宫实验测试大鼠的学习记忆能力，使用放射免疫法测试大鼠血浆ACTH及CORT含量，采用免疫组织化学结合图像半定量方法对海马CA1、CA3区NGF神经元的数量及面积进行测量和分析。结果显示： 1）与应激模型组相比，应激运动组大鼠穿越格数、直立次数及修饰次数均显著增加（P<0.01，P<0.05，P<0.05），中央格停留时间显著缩短（P<0.05），悬尾不动时间缩短（P<0.05）；2）与应激模型组相比，应激运动组大鼠完成八臂迷宫时间显著缩短（P<0.05），RME及TE均显著减少（P<0.05，P<0.05）；3）与应激模型组相比，应激运动组大鼠血浆ACTH及CORT含量显著降低（P<0.05，P<0.01）；4）与应激模型组相比，应激运动组大鼠海马CA1区、CA3区NGF免疫阳性细胞数量及面积均显著增加（P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05）。得出结论：跑台运动可改善抑郁模型大鼠的学习记忆能力，机理可能与长期运动降低抑郁大鼠的血浆ACTH及CORT水平、拮抗HPA轴功能亢进及增强海马CA1区、CA3区NGF的表达有关。

关键词： 跑台运动；抑郁模型；学习记忆；海马；神经生长因子

中图分类号： G 804.7文章编号：1009-783X（2015）01-0000-00文献标志码： A

抑郁症（depression）是一类常见的以长期持续性情绪低下为主的心境障碍性疾病，呈慢性、反复发作，以显著而持久的情绪低落、活动能力减退、思维与认知功能迟缓为主要表现，是严重危害人类身心健康的常见病。根据世界卫生组织统计全球超过1.21亿人患有抑郁症，从人类抑郁症发病的原因来看，应激性生活事件是抑郁症的明显促发因素。慢性不可预知性应激（chronic unpredictable stress，CUS）是近年来国内外应用最为广泛的抑郁动物模型之一，它可模拟抑郁的核心症状-快感缺乏及行为绝望，目前被广泛运用于抑郁症的病理生理机制、抗抑郁药物研发及作用机制研究。学习记忆能力降低是抑郁症状的重要表现，实验表明一定程度的应激可以引起大鼠及人类学习记忆能力的减退[1-2]，许多学者研究认为，长期有氧锻炼可以改善人类情绪障碍及认知功能的缺陷，Clark等[3]研究发现，长期运动锻炼能降低应激导致的啮齿动物的焦虑行为，改善动物的认知功能，然而机制尚不清楚。

在中枢神经系统中，与应激关系密切的脑区主要有海马、杏仁核、下丘脑、前额叶皮层及纹状体等部位。海马是边缘系统的重要组成部分，是学习记忆和情绪整合的神经中枢，其结构损伤可能是抑郁症患者情绪低落和学习记忆能力下降的基础[4]。依据细胞形态、不同皮质区发育的差异以及纤维排列的不同可将海马划分为4个不同区域CAl、CA2、CA3和DG区，不同区域的功能不尽相同，研究认为慢性应激引起大鼠抑郁样行为与海马CA1、CA3区的形态学改变有关[5]，而且海马Cal、CA3区在动物的信息处理及空间记忆方面承担着较为重要的作用[6]。神经生长因子（nerve growth factor，NGF）属于神经营养因子家族成员，广泛地分布在中枢神经系统中，对皮质、海马和基底前脑的胆碱能神经元有神经营养作用，对神经元的可塑性及其形成和生存起重要调节作用。研究发现NGF在抑郁症的发病机理中起重要作用，与应激导致的抑郁样行为及神经形成减少有关[7-8]。因此，本实验以海马CA1、CA3区为研究重点，通过复制CUS大鼠模型观察跑台运动4周后大鼠抑郁行为（探索行为及绝望行为）及空间学习记忆能力的改变和海马CA1、CA3区NGF表达的变化，探讨跑台运动改善抑郁模型大鼠抑郁行为及学习记忆能力的可能机制。

1材料与方法

1.1动物及分组

雄性成年SD大鼠体重200～220 g，饲养温度（20±2）℃，相对湿度（55±10）%，12 h昼夜节律（光照时间7：00～19：00），自由饮食。适应环境饲养1周后，将30只大鼠随机分为3组：1）正常对照组（C）；2）应激模型组（SM）；3）应激运动组（SE），每组10只。应激模型组及应激运动组大鼠单独分笼喂养。

1.2慢性应激抑郁模型的制备

慢性不可预知应激抑郁动物模型参照Willner的方法[9]，造模方法如下：禁水（24 h）、悬尾（5 min）、束缚（2 h）、4 ℃冷水强迫游泳（5 min）、禁食（24 h）、45 ℃环境（5 min）、昼夜颠倒（24 h）、20 min电击足底（0.8 A，每次持续4 s、间隔5 min），每天给予1次刺激，刺激随机安排到4周内，使大鼠不能预料刺激的发生，以避免发生适应性。

1.3跑台训练方案

1）应激模型组大鼠从第2周开始接受为期4周的CUS程序。2）应激运动组：跑台训练前大鼠进行1周适应性训练，正式训练时，每天下午进行跑台运动，大鼠0坡度跑台运动4周，第1～2周大鼠每天运动30 min（10 m/min×3），第3周每天运动45 min（15 m/min×3），第4周每天运动60 min（15 m/min×4），跑台训练期间每个程序之间大鼠休息5 min。跑台训练时不使用电击装置驱赶大鼠，以避免对大鼠施加不良应激，同时每天上午接受1次CUMS程序，为期4周。3）正常对照组：在整个实验过程中，正常对照组大鼠除了必要的例行鼠笼清洁，不做任何干扰[10]。

1.4旷场实验

慢性应激及跑台运动结束后第2天，所有大鼠进行旷场实验以评估大鼠的一般运动能力及探索行为。开场实验箱大小为100 cm×100 cm×50 cm，底面用黑线分为面积相等的25个方格（20 cm×20 cm）。每只大鼠放在实验箱中央让自由探索5 min，实验箱正上方装有一个摄像头监视大鼠在箱内的活动，主要观察中央格停留时间、穿越格数、直立次数、修饰次数及粪便颗粒。每次实验后将粪便清除干净。

1.5悬尾实验

参见Stem等报道的方法[11]，旷场实验结束后次日，将大鼠尾巴距尾尖部约l cm处用胶布贴于悬尾箱（30 cm×30 cm×25 cm）支架上，使大鼠成倒挂状态，其头部离箱底约5 cm，一次悬挂2只大鼠，中间用隔板隔开。悬挂时间为6 min，统计大鼠后4 min内悬尾累积不动时间（不动状态即大鼠停止挣扎不动或无任何活动）。

1.6八臂迷宫实验程序

悬尾实验结束后次日，所有大鼠进行八臂迷宫实验，实验前大鼠先在迷宫中适应2 d，每天2次。适应时，迷宫各臂及中央区分撒食物颗粒，然后同时将4只大鼠同时置于迷宫中，让其自由摄食、探究10 min，适应迷宫环境。正式训练时，将食物放在其中的四臂（分别为1、3、5、7号臂）。大鼠置于迷宫中央区，此时中央区四周用鼠门关住，15 s后将门打开并开启分析测试软件。大鼠可自由选择进入放射状臂觅食，直至10 min末或提前吃完四臂食物，即结束一次训练。测试指标：1）完成八臂迷宫的时间（TT）；2）工作记忆错误（WME）：重新进入放食物臂或第1次进入放食物臂而不摄取食物；3）参考记忆错误（RME）：进入不放食物臂；4）总记忆错误（TE）：工作记忆错误与参考记忆错误之和。

1.7大鼠海马CA1、CA3 区NGF测试

八臂迷宫行为测试结束后即刻，每组大鼠经腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，开胸（同时心脏取血2 ml测血浆ACTH及cort含量），经常规灌注固定，石蜡包埋后常规脑组织切片，片厚5 μm，进行NGF免疫组织化学染色（免疫组化检测试剂盒为武汉博士德公司生产）。将石蜡切片置于65 ℃烤箱中烤片1 h，常规脱蜡，梯度酒精脱水，入3%H2O2-甲醇液，室温孵育30 min，然后加入NGF 血清第一抗体（兔IgG，37 ℃孵育1 h），0.1 molPBS洗2 min×3，随后加入生物素标记的羊抗兔抗体37 ℃孵育1 h；接着入ABC液，37 ℃孵育1 h，DAB呈色、苏木素轻度复染、裱片、脱水、透明、封片。

1.8各组大鼠血浆ACTH及CORT含量测试

各组大鼠心脏取血（取血测血浆ACTH、CORT含量），每只采血量1.0 ml，放入加有肝素钠的试管，4 ℃、4 000 r/min离心10 min，分离血浆，平均分放在2个EP管，贴好标签，储藏在温度为-20 ℃冰箱用于ACTH及CORT含量测定，严格按照试剂盒说明书进行。

1.9图像分析和统计学处理

根据大鼠脑立体定位图谱确定大鼠海马CA1、CA3的位置（1A-B），用数码显微镜拍片，江苏捷达形态学分析软件对大鼠海马CA1、CA3区NGF阳性神经元的表达进行分析，计数NGF阳性细胞个数及面积（400倍）。采用SPSS 18.0软件进行

统计分析，数据结果用X±SD表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVE）对组间差异进行统计，以P<0.05表示统计学上具有显著性差异，P<0.01表示统计学上具有极显著差异。

图 1A-B 冠状位下海马CA1、CA3区NGF截面图，箭头所示

2研究结果

2.1各组大鼠旷场实验及悬尾实验结果

表1结果显示：与正常对照组比较，应激模型组大鼠中央格停留时间显著延长（P<0.01），穿越格数、直立次数及修饰次数均显著减少（P<0.01，P<0.01，P<0.01），粪便颗粒增加（P<0.05），悬尾不动时间延长（P<0.01）；经过4周跑台运动，与应激模型组比较，应激运动组大鼠穿越格数、直立次数及修饰次数均显著增加（P<0.01，P<0.05，P<0.05），粪便颗粒与应激模型组比较无统计学意义，中央格停留时间和悬尾不动时间显著缩短（P<0.05，P<0.05）。

2.2大鼠八臂迷宫行为学测试结果

表2结果显示：与正常对照组比较，应激模型组大鼠完成八臂迷宫时间显著延长（P<0.01），工作记忆错误次数（WME）及参考记忆错误次数（RME）均显著增多（P<0.01，P<0.05），总记忆错误次数（TE）远远高于正常对照组（P<0.01）；与应激模型组比较，应激运动组大鼠完成八臂迷宫时间显著缩短（P<0.05），RME及TE均显著减少（P<0.05，P<0.05），WME与应激模型组大鼠比较无统计学意义。

2.3各组大鼠血浆ACTH、Cort结果

如表3所示，与正常对照组比较，应激模型组大鼠血浆ACTH及CORT含量均显著增加（P<0.01，P<0.01），增加幅度为88%及97%；经过4周跑台运动，应激运动组大鼠血浆ACTH及CORT含量降低（P<0.05，P<0.01），下降幅度分别为23%及27%，提示长期跑台运动可能通过拮抗慢性应激诱导的HPA轴功能亢进，从而达到抗抑郁目的。

2.4各组大鼠海马CA1、CA3区NGF表达结果

海马CA1、CA3区内分布有大量NGF，胞浆染色，胞核不染色，形态规则，且排列密集，胞体形态多种多样呈圆形或椭圆形，如图2、图3所示。由表4可知：与正常对照组比较，应激模型组大鼠海马CA1区NGF免疫阳性细胞数量及面积均显著减少（P<0.01，P<0.01）；经过4周跑台运动应激运动组大鼠海马CA1区NGF免疫阳性细胞数量及面积均显著增加（P<0.05，P<0.05）。与正常对照组比较，应激模型组大鼠海马CA3区NGF免疫阳性细胞数量及面积均显著减少（P<0.01，P<0.01）；经过4周跑台运动应激运动组大鼠海马CA3区NGF免疫阳性细胞数量及面积均显著增加（P<0.05，P<0.05）。

注：免疫组织化学结果显示应激模型组大鼠海马CA1区 NGF免疫阳性神经元（→）表达减弱；跑台运动4周后大鼠NGF免疫阳性神经元（→）表达增强。A：对照组；B：应激模型组；C：应激运动组。

图 2A-C：海马CA1区NGF阳性神经元分布

注：免疫组织化学结果显示应激模型组大鼠海马CA3区NGF免疫阳性神经元（→）数量及面积均显著减少；跑台运动4周后大鼠NGF免疫阳性神经元（→）数量及面积均显著增加。A：对照组；B：应激模型组；C：应激运动组。

图 3A-C：海马CA3区NGF阳性神经元分布

3讨论

3.1跑台运动对抑郁模型大鼠抑郁行为及学习记忆能力的影响

慢性不可预见性应激抑郁模型与人类抑郁症中慢性、低水平的应激源促进疾病发生、加速疾病发展的机理接近。由于抑郁症涉及情绪、行为和躯体方面的功能紊乱，是1种“全身性”的疾病，因此，应激因子的多变性和不可预测性是模型制造成功的关键[12]。本研究所涉及的行为学实验中，悬尾实验评价的是动物的“绝望”情绪，其原理是利用动物悬尾后企图逃脱但又无法逃脱，从而放弃挣扎，进入特有的抑郁不动状态，以一定时间内动物的不动时间来反映其“绝望”情绪，这种行为绝望与抑郁症类似[13]。本实验中，大鼠停止挣扎、处于不动状态的时间延长，反映了大鼠悲观、绝望程度增加。旷场实验是一个用动物行为指标检测类似于人的复杂情绪如焦虑、抑郁等的经典实验，可检测动物的自发行为和探究行为，可用来测试动物中枢神经系统的“兴奋”或“抑郁”状态[14]。水平穿越格数及直立次数表示大鼠的探究行为，中央格停留时间表示大鼠启动活动的潜伏期及大鼠进入1个陌生环境后对新环境的好奇程度，停留时间越长越能反映大鼠对新环境的淡漠心理，理毛时间反映大鼠对周围环境的警觉性及对自身的关注，排便量反映大鼠的紧张恐惧状态。本实验结果显示，应激模型组大鼠穿越格数、直立次数及修饰词数均显著减少，中央格停留时间延长，粪便颗粒增加，强迫游泳实验中大鼠停止挣扎、处于不动状态的时间延长。这些行为表明正常大鼠在各种应激因子慢性刺激作用下，大鼠活动及探究能力降低，对新鲜环境的好奇程度下降，兴趣丧失，大鼠悲观及绝望程度增加，提示本实验中大鼠抑郁模型的复制是成功的。

八臂迷宫已被公认为一种比较理想的评估啮齿动物空间学习记忆能力的模型，该模型已被广泛接受和应用。研究发现，学习记忆能力降低是抑郁症状的重要表现[15]。本实验通过八臂迷宫实验证实，与对照组比较，应激模型大鼠完成八臂迷宫时间显著延长，参考记忆、工作记忆错误次数及总错误次数显著增加，学习记忆能力明显下降，这与多数学者的研究结果一致[16]。许多学者研究发现有氧运动可以改善抑郁病人的情绪低落及认知功能的下降情况，而且运动作为1种预防抑郁病人复发的治疗方法，其效果优于抗抑郁药[17]。在本实验中，笔者设计的抑郁模型大鼠跑台运动为4周，而且本研究也证实，经过4周跑台运动，旷场试验中应激运动组大鼠的活动度增加、对新环境的好奇程度增强，悬尾实验中，大鼠不动时间缩短，八臂迷宫实验中应激运动组大鼠完成八臂迷宫时间缩短、参考记忆错误次数及总错误次数显著减少、学习记忆能力明显增强，提示长期跑台运动可以在一定程度上改善抑郁模型大鼠对新环境的好奇程度减弱情况并能对抗抑郁大鼠的绝望行为，增强大鼠的学习记忆能力，具有抗抑郁作用。

3.2跑台运动对抑郁模型大鼠血浆ACTH及CORT含量的影响

应激可使机体出现抑郁、学习记忆障碍、应激性精神紊乱等多种疾患，而这些疾患的发生及严重程度与下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）持续亢进密切相关[18]。HPA轴作为大脑应激应答的重要机制之一，在抑郁症的病因、病理学机制中起关键作用。当机体受到刺激时，下丘脑室旁核（PVN）小细胞神经元分泌包括CRH在内的多种促进ACTH分泌的激素，进而刺激垂体分泌ACTH，ACTH经血循环达肾上腺，促使糖皮质激素分泌增多，过量的糖皮质激素能导致机体出现抑郁症状[19]。CORT是HPA轴的重要激素，对恐惧和焦虑情绪作用明显。动物实验显示，高糖皮质醇血症时，海马神经元将受损[20]，而对抑郁症患者死亡后的大脑组织进行尸检，也有类似的发现。海马是HPA轴应激反应的高位调节中枢，海马内含有较高密度的糖皮质激素受体，长期过量的糖皮质血症使海马神经元萎缩死亡，而海马神经元的损害将打断了正常应激反应时海马对HPA轴的抑制作用而形成恶性循环。本实验得到相同结果，经过4周慢性不可预知应激大鼠血浆ACTH及CORT水平较正常对照组相比均显著增加，增幅分别达到88%及97%，说明慢性应激导致抑郁大鼠HPA轴功能紊乱。可能的原因如下，HPA轴自身具有分泌激素的功能，在应激过程中HPA轴所涉及的激素CRH、ACTH和CORT相互作用构成1个负反馈调节系统。慢性应激使机体负反馈抑制效应减弱，从而出现ACTH及CORT的分泌高峰，导致HPA轴功能的亢进，引起机体出现神经内分泌等多系统的功能紊乱，进而出现抑郁症的各种症状[21]。

动物实验表明，长期跑台运动可通过拮抗HPA轴功能亢进改善抑郁大鼠的抑郁样行为及学习记忆能力的下降[22]。本研究也证实了此观点，4周跑台运动可以减少慢性应激致抑郁大鼠ACTH及CORT的过度分泌，行为学测试表现为慢性应激大鼠的活动度增加，大鼠对新环境的好奇程度增强，绝望程度改善，慢性应激导致的抑郁样行为及学习记忆能力显著改善。从而提示运动能够有效地改善慢性应激大鼠的抑郁状态，阻断应激对HPA轴的刺激作用及维持HPA轴的稳定，提示运动可能通过对海马神经元的损伤进行修复，从而对HPA轴起到作用，具体机制还有待进一步研究。

3.4跑台运动对抑郁模型大鼠海马CA1、CA3区NGF表达的影响

抑郁症的病理机制目前尚不完全清楚，但海马脑区损伤这一点已得到大家普遍认同。海马是边缘系统的重要组成部分，参与情绪、学习和记忆、行为、免疫等的调节，它的损伤在各种应激所致疾患中起到关键作用[23]。研究显示，慢性应激可导致海马出现体积减小、细胞数目减少、细胞萎缩及增生抑制等多种神经元可塑性受损的表现，同时伴有学习、记忆和情绪反应的缺陷[24]。海马CA3区是一个对应激极度敏感的亚区，从病理上推测分析，海马体积减小初期主要是由于CA3区锥体细胞的萎缩和死亡导致的。而如果应激持续存在，将主要导致齿状回的颗粒细胞再生抑制及CAl区神经细胞的萎缩与凋亡。而且研究证实，应激可以导致海马CA1、CA3区域的形态学改变，这可能与海马功能的损害有关。Sousa等[25]发现不可预测的慢性应激使大鼠海马CAl区锥体细胞树突总长度减少13%，大鼠学习记忆能力显著下降。

中枢神经系统中的NGF在大脑皮质和海马等靶组织中合成，经基底前脑胆碱能神经元摄取，逆行运输到胞体，对中枢神经元的生长和生存起重要作用，特别是对投射到海马和大脑皮质区域的胆碱能神经元起保护作用[26]。海马是大脑内合成NGF的重要场所，也是介导应激反应的重要脑区之一[27] 。研究表明，慢性应激可以导致海马神经元可塑性受损[28]，以及NGF表达的降低[29]，提示海马NGF表达减少以致神经元功能受损可能在抑郁症的发病过程中起关键作用。本研究结果发现，长期慢性应激组大鼠海马CA1、CA3区NGF表达明显减弱，同时大鼠学习记忆能力显著下降，可以推测慢性应激导致的海马CA1、CA3区NGF减少可能是抑郁导致大鼠学习记忆能力下降的病理机制之一。而应激运动组大鼠跑台运动4周后海马CA1、CA3区NGF表达明显增强，提示慢性应激大鼠经过长期跑台运动八臂迷宫成绩提高可能与海马CA1、CA3区NGF表达增强有关。可能的原因如下，长期慢性应激刺激导致下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）功能亢进，出现高CORT血症，缝核-海马系统5-HT等单胺系统传导功能低下、兴奋性氨基酸（EAA）释放，受体后信号转导系统异常（包括Ca2+失衡），导致NGF含量及其mRNA水平下降[30]。研究认为，NGF通过增加过氧化氢酶和超氧化物歧化酶等自由基清除剂的活性，对减轻神经元损伤起重要作用[31]。也有研究表明NGF对海马神经元钙离子浓度的升高和神经元的坏死有明显的抑制作用[32]。而且海马CAl、CA3区在学习记忆中担负着尤其重要的作用，因此，可以推测长期跑台运动增强慢性应激大鼠学习记忆能力主要与此运动拮抗HPA轴功能亢进、减少Cort分泌导致海马CA1、CA3区NGF表达增强，从而阻止氧化应激引起的中枢神经元死亡有关。

4结束语

本实验结果显示：大鼠经过4周慢性不可预知应激大鼠血浆ACTH、CORT含量显著增加，大鼠海马CA1、CA3区NGF表达明显减弱，提示血浆ACTH、CORT含量及NGF的变化与慢性应激导致的大鼠的抑郁样行为及学习记忆有关。经过长期跑台运动，大鼠血浆ACTH、CORT含量减少，NGF表达增加，提示长期跑台运动可以有效调整血浆ACTH、CORT水平，上调NGF的表达，从而改善抑郁模型大鼠的抑郁样行为及学习记忆能力，具体机制有待于进一步研究。

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