外源NGF促进大鼠皮肤创面模型损伤修复的机制研究

李政懋+吕辰+杨选鑫+张宏宇

（温州医科大学药学院分子药理研究中心 温州 325035）

摘 要 目的：探究外源NGF对大鼠创面的治疗作用及机制。方法：在SD雄性大鼠的背部脊柱的两侧手术切开形成两个2 cm x 2 cm的伤口，右边伤口处给予20 mg/ml NGF 1 ml，左边伤口给等量生理盐水作为对照组。隔天给药到第14天（第14天停止给药），分别于d3、d7、d14统计创面伤口愈合率，并取这3个时间点的组织用免疫组化的方法检测转化生长因子 （ transforming growth factor-β1，TGF-β1）、CD68-阳性巨噬细胞、增殖性细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF-1）的表达量。结果：NGF组的创面愈合率明显高于生理盐水组，并且NGF组TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的蛋白表达量也显著高于生理盐水组（P<0.05）。结论：外源NGF具有促进创面愈合作用，其机制可能与趋化炎症因子、加快血管生成、促进PCNA、TGF-β1的表达相关。

关键词 神经生长因子 创面修复 炎症趋化因子 血管生成 细胞增殖

中图分类号：R628 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2014）17-0051-04

Study on the mechanism of exogenous nerve growth factor

in accelerating the wound healing in the model of rats with skin damage

LI Zhengmao， LV Chen， YANG Xuanxin， ZHANG Hongyu*

（The Institute of Molecular Pharmacology， Wenzhou Medical University， Wenzhou 325035， China）

ABSTRACT Objective： To study the therapeutic effect of nerve growth factor （NGF） on wound healing in rats and its mechanism. Methods： Two full thickness wounds （2 cm x 2 cm） extending through the panniculus carnosus were made on both sides of the back spine in SD male rats. The right incision （designated as an experimental group） was treated with 1 ml of NGF （20 mg/ml， dissolved in 0.9% sterile saline） every other day till 14th days while the left incision （designated as a control group） with equal amounts of 0.9% sterile saline. The rates of wound healing were recorded at day 3， 7 and 14 and the expression of transforming growth factor-β1 （TGF-β1）， CD68+ macrophages， proliferating cell nuclear antigen （PCNA） and vascular endothelial growth factor （VEGF-1） in wound tissues sampled at day 3，7 and 14 were detected by immunohistochemistry staining. Results： The rates of wound healing and the protein expression of TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1 were obviously higher in the experimental group than in the control group （P<0.05）. Conclusion： The mechanism of NGF in the promotion of wound healing might be related to the chemotactic factor， the promotion of angiogenesis and the expression of PCNA and TGF-β1.

KEY WORDS nerve growth factor； wounds healing； chemotactic factors； vasculogenesis； cell proliferation

神经生长因子（NGF）最早于1953年被Levi-Montalcini发现，并因此获得了1986年诺贝尔医学生理学奖。目前多用的是鼠源性NGF，包含a、b、g 3个亚单位，活性区是b亚单位，由两个118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体[1] 。研究发现NGF具有：①促进神经元分化再生[2] ；②维持神经元的存活、生长、发育，尤其是对多巴胺能神经元的保护作用；③促进神经元的修复[3] ；④促进创口的表皮细胞、真皮细胞的生长，使其修复愈合[4] 。

皮肤创伤是一个复杂的病理过程，包括炎症反应、细胞增殖、创面收缩、胶原代谢、新生血管形成及增殖、感觉末梢神经的恢复等基本过程，临床表现为局部炎症反应、细胞增殖分化及肉芽组织形成、组织重建三个阶段[5] 。大量研究证实：创面愈合的各阶段均有NGF参与并发挥重要作用。本研究将通过构建大鼠皮肤创伤实验模型，给予外源NGF治疗，在不同的时间点统计伤口愈合率，通过免疫组化染色对TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的蛋白表达量进行检测分析，探讨NGF促进皮肤创伤修复的相关机制。

材料与方法

材料

SPF级成年雄性SD大鼠30只，体重200～250 g，购自上海斯莱克实验动物中心（医动字第04-20-3号）。UltraSensitiveTM S-P 超敏试剂盒（福州迈新，产品编号：KIT-9710）。外源性NGF由厦门北大之路生物科技有限公司提供。

方法

动物模型的建立

用8%的水合氯醛对实验大鼠经腹腔注射进行麻醉，麻醉后固定于简易操作台，剪去背部毛发，用碘伏对背部皮肤进行消毒。用剪刀在其背部以脊柱为对称轴的两侧剪两个2 cm x 2 cm的伤口。右侧伤口给20 mg/ml NGF 1 ml，左侧给予等量的无菌生理盐水（0.9%氯化钠溶液）。隔天给药到第14天（第14天不给药）。

创面愈合率的统计

分别于d1、d3、d7和d14量取伤口未愈合面积（用透明的纸画下伤口面积，再将画下的面积复印到坐标纸上，数格计算出面积），计算比较伤口愈合率。伤口愈合率（%）=（开始时伤口面积-取材日伤口面积）/开始时伤口面积×100%[6] 。

皮肤组织处理

1）于d3、d7各处死5只大鼠，d14处理全部大鼠，取其背上创面的全层皮肤，进行石蜡包埋处理，切片厚度为7 mm。

2）通过免疫组化将已经包埋好的组织切片进行染色检测，依次经过二甲苯及不同浓度梯度的酒精进行脱蜡后，在清水中冲洗一段时间，加入3% H2O2浸泡10 min，除去内源性的过氧化氢酶后再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中加热3 min（温度：95 ℃左右），使抗原的位点暴露出来，冷却至室温后进行血清封闭。再依次进行加一抗、二抗、SABC和由DAB/H2O2/磷酸缓冲液配置的染色液处理。随后加入苏木精中复染，脱水后进行封片，检测TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的蛋白表达量，根据检测结果进一步对NGF是否有促进创面愈合作用作出判定[7-10] 。

结果

创面愈合率

NGF组与生理盐水组在d1、d3、d7、d14的皮肤愈合率见表1，其差异具有统计学意义（P<0.05），表明外源NGF能够加速创面的愈合。

TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的蛋白表达量

TGF-β1是一族多肽类生长因子，可以作用于成纤维细胞，促进细胞增殖分化，抑制细胞凋亡，合成胶原蛋白，并调节创伤中各细胞间的相互作用，加速创面的愈合[7]。TGF-β1抗原表达多少与细胞增殖成正相关，可以反映出细胞的增殖状态。由此推断NGF能促进细胞增殖，从而促进伤口愈合（图1）。

CD68是主要的单核-巨噬细胞抗原，其表达可以反应出巨噬细胞的分布，推测NGF可以诱导炎症细胞在创面的聚集（图1）。

PCNA阳性表达的强弱代表细胞增殖活动的高低，在细胞增殖的启动上起着重要作用，是目前能较好反映细胞增殖状况的指标[8]。表明NGF有利于伤口的愈合（图1）。

VEGF-1作为一种血管生成调节因子，在创伤早期的大量表达有助于伤口的愈合[9-10]。推断NGF可以促进VEGF-1表达，使创面处的血管细胞处于增殖状态，从而加快伤口的愈合（图1）。

讨论

创伤愈合是一个涉及分子、细胞和组织水平的复杂生物学过程。在创面组织损伤修复过程中，细胞因子几乎调控损伤后皮肤再生的全过程，包括细胞趋化、增殖、基质合成与降解、炎症反应等多方面。TGF-β1作为一种大分子复合体作用于成纤维细胞，促进细胞外基质产生并抑制其降解，对细胞增殖、分化起重要调节作用[11]。CD68在伤口炎症反应阶段主要是趋化、聚集炎症细胞，并清除坏死组织及细胞碎片[12] 。PCNA可促细胞增殖，并在细胞生长S期大量表达，故可将其作为评价细胞增殖状态的重要指标[13] 。VEGF-1可直接作用血管内皮细胞，加强血管通透功能，促进血管内皮细胞增殖而形成新血管[14-15] 。以上4种蛋白的作用均在创伤愈合过程中有重大意义。

NGF作为一种神经生长因子，与碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）都是多功能的生物活性多肽，目前在临床创面修复治疗中，bFGF冻干粉已经成为一种重要的生物治疗药物。有文献报道，在切断成年大鼠的坐骨神经后，坐骨神经断端吻合口处会立刻观察到内源性NGF大量表达[5，16] ，表明NGF也会参与细胞的再生修复及伤口愈合的过程。由此推测NGF在创面愈合方面具有与bFGF相似的生物学效应[17]。为进一步探究NGF对皮肤创伤愈合的修复机制，本研究通过外源给予创伤模型NGF，并于不同的时间点对创面的愈合情况进行统计分析，发现NGF组的愈合情况要明显好于生理盐水组，但需要考虑到的一点是，大鼠皮肤与人体皮肤存在着差异，相对而言大鼠对皮肤创面具有更强的修复作用，因此在表1中，NGF组与生理盐水组在d14都有较好的愈合效果。但总体而言，给予NGF后能够显著提高创面修复能力。本文实验还分别对TGF-β1、CD68、PCNA、VEGF-1的表达量进行检测，发现TGF-β1在d3、d7的表达量明显高于生理盐水组，愈合完全后（d14）表达量有所下降，原因可能是由于NGF组在d14已经达到几乎完全愈合的效果，因此TGF-β1的表达量有所下降，而生理盐水组在d14并未达到完全愈合效果，所以TGF-β1的表达量仍处于一个相对较高的水平。同样地，NGF组的CD68、PCNA、VEGF-1的表达量在d3、d7也显著高于生理盐水组，并在d14相对低于生理盐水组，这表明了NGF的给予会促进这4种蛋白的表达，从而达到加快伤口愈合的生物学效应。另外发现给予NGF后，PCNA在d3的表达要高于d7，推测其原因为大鼠皮肤出现创面时，其机体自身会即刻通过不同的细胞增殖来进行创面的修复，因而在d3其表达量较高。而NGF促进创面愈合的作用很有可能与促进胶原蛋白的沉积、血管的生成、加速伤口处的血液循环，使氧和营养物质能够到达伤口部位，让细胞得到充分的增殖，为伤口愈合提供有利的条件等有关，其具体机制仍有待于进一步的研究探明。

由此可见，NGF在创面修复中潜在的应用价值正在渐渐的凸显出来。继续探究NGF对创面愈合的修复机制，更好地利用NGF自身的生物学特点，将是今后研究的一个重点和方向，也将为临床治疗难愈创面提供新的策略。

参考文献

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（收稿日期：2014-06-10）

由此可见，NGF在创面修复中潜在的应用价值正在渐渐的凸显出来。继续探究NGF对创面愈合的修复机制，更好地利用NGF自身的生物学特点，将是今后研究的一个重点和方向，也将为临床治疗难愈创面提供新的策略。

参考文献

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（收稿日期：2014-06-10）

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（收稿日期：2014-06-10）