水貂大肠杆菌的分离?鉴定及药敏试验

孙蓉蓉　邹玲　刘文华　张灿　李文立　任慧英

摘要[目的]为更好预防水貂大肠杆菌病提供依据。[方法]从山东某大型水貂养殖场采集病料，通过病原分离、培养特性、染色特性和生化试验等对病原进行分离与鉴定，并对分离菌进行药敏试验。[结果] 共分离致病菌18株，其中有10株为大肠杆菌，说明该养殖场主要的细菌病为大肠杆菌感染。药敏试验结果表明分离出的大肠杆菌对大多数抗菌药物敏感。[结论] 水貂发生细菌病后，应尽可能通过药敏试验筛选敏感药物，避免盲目投药。

关键词 水貂；大肠杆菌；分离；鉴定；药敏试验

中图分类号 S852.6 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）11-119-01

水貂大肠杆菌病是水貂的一种肠道传染病，常呈败血型经过，伴有严重下痢，侵害呼吸器官，死亡率高[1]。自20世纪80年代以来，山东省水貂养殖场数量逐年增加。据海关贸易总署统计，全国平均年产水貂皮1 200万张，其中山东省占2/3。养殖水貂利润很高，是农民脱贫致富的有效途径，深受农民的欢迎[2]。由于养殖水貂的规模不断扩大，水貂抗病力逐年降低。条件性致病菌是继发水貂细菌病的主要病原，给水貂养殖业带来巨大的经济损失，也制约了水貂养殖业的进一步发展。

近年来，科研工作者对水貂病毒性疾病的研究较为深入，并且已经得到一定控制，而对水貂细菌性疾病的相关报道则很少。笔者通过对山东省威海市某大型养殖场的病料采集，分离并鉴定了10株水貂大肠杆菌，并对分离菌株进行了药敏试验，以期为更好地预防水貂大肠杆菌病提供依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源

病料采自山东省威海市某水貂养殖场新鲜病死水貂。

1.2 主要试剂

普通营养琼脂培养基、麦康凯琼脂、三糖铁琼脂（TSI），均购自北京路桥技术有限公司；大肠杆菌显色培养基为青岛海博生物技术有限公司产品；葡萄糖蛋白胨水、糖发酵管、西蒙氏枸橼酸盐琼脂、药敏纸片均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 细菌的分离

无菌取病死水貂的肝脏，分别划线接种于普通营养琼脂、麦康凯琼脂培养基，37 ℃恒温培养24 h，观察细菌生长情况及菌落特征。

1.4 细菌的纯化及形态观察

取初步分离的细菌，划线接种于麦康凯培养基及大肠杆菌显色培养基上，37 ℃恒温纯化培养24 h，挑选典型菌落在新鲜斜面上进行纯培养。挑取1环细菌的纯培养产物，按照常规方法进行革兰氏染色镜检。

1.5 生化鉴定

1.5.1糖类代谢试验。 挑取麦康凯培养基上的典型菌落，接种微量糖发酵管、三糖铁琼脂培养基，37 ℃条件下恒温培养24 h后观察结果。

1.5.2 其他生化反应。

挑取麦康凯培养基上的典型菌落，按照常规方法进行吲哚试验、MR试验、VP试验及柠檬酸盐利用试验（合称IMViC试验）[3]。

1.6 纸片扩散法药敏试验

将浓度为10.8 CFU/ml的新鲜菌液涂布普通营养琼脂平板，放置5 min后将18种药敏纸片贴于平板表面，37 ℃条件下培养18 h后观察结果，按照CLSL标准进行药物敏感性评价[4]。

2 结果与分析

2.1 细菌培养结果

从28份病料共分离出18株细菌。分离菌在普通琼脂培养基上形成圆形隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、半透明的灰白色菌落；其中，10株分离菌在麦康凯培养基上形成桃红色、光滑、中等大小的菌落。在大肠杆菌显色培养基上形成蓝绿色菌落。

2.2 形态及生化鉴定

将各分离菌进行革兰氏染色并镜检，可见淡红色、短小的杆状细菌。各分离菌均可以分解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇，产酸产气，60%的菌株还利用蔗糖；三糖铁琼脂培养基上斜面和底层均产酸，变黄，产气，不产生硫化氢；IMViC试验结果为“+ + - -”。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》可知，上述分离菌均符合大肠杆菌的特性[5]，因此可以确定其为大肠杆菌。

2.3 药敏试验结果

根据CLSI标准可知，10株大肠杆菌对不同药物的药敏纸片的抑菌情况如表1。

从表1可以看出，10株水貂大肠杆菌分离株对18种抗生素均有不同程度耐药，其中环丙沙星、诺氟沙星、链霉素、四环素、氨苄西林5种抗菌药的耐药性都大于50%，而对头孢哌酮、头孢他啶、头孢吡肟的耐药率为0。10株大肠杆菌分离株对18种抗生素的敏感性也有所不同，以头孢西叮、头孢他啶、头孢吡肟敏感率最高，达到100%。除1株大肠杆菌仅对四环素耐药（1耐）外，其他均为多耐菌株，其中2个2耐菌株，1个3耐菌株，1个4耐菌株，2个7耐菌株，1个9耐菌株，2个菌株同时对13种抗菌药物表现为耐药。

3 讨论

笔者对某大型养貂场进行了为期3个月的病料采集，共收集28次（份）病料，经实验室分离与鉴定，共获得10株大肠杆菌，分离率为35.7%，说明大肠杆菌是该养貂场的主要细菌病原，这与文献中的大肠杆菌病是水貂常发病的报道一致[6-8]。大多数大肠杆菌是人类和动物肠道中的共栖菌，但当细菌发生移位，入侵肠外组织，即成为条件性致病菌，另外，还有某些血清型的大肠杆菌是人类和动物的重要致病菌[9]。水貂大肠杆菌病的发病与饲养场内的饲养管理、饲料、环境卫生和气候变化等有密切的关系，因此，临床防治大肠杆菌病，水貂场应严格控制饲养管理，不能混群饲养，同时要严格管理饲养卫生，增强消毒意识，做到定期消毒， 减少环境中致病菌的含量，从而有效减少致病菌对水貂的侵害，气候剧变时可以适当使用药物预防。饲喂安全的饲料可以有效减少水貂大肠杆菌病的发生。对来源不明的动物性饲料，必须经高温加工后方可饲喂[10]。

此次分离的10株水貂大肠杆菌对头孢西叮、头孢他啶和头孢吡肟3种抗菌药物的敏感率为100%，对其他15种抗菌药物则表现为不同程度的耐药，有2株大肠杆菌可对13种药物同时耐药。多重耐药现象的出现与水貂细菌病防治中滥用抗菌药物有很大关系，许多养殖户不按照剂量及疗程给药治疗，或在饲料及饮水中长期添加抗菌药物进行疾病预防，都会造成耐药性提高。药敏试验结果表明，水貂发生细菌病后应尽可能通过药敏试验筛选敏感药物，避免盲目投药。

参考文献

[1]赵纯德，应祯灏，王林志，等.舟山市三起水貂大肠杆菌病的诊治报告[J].毛皮动物饲养，1989（4）：22-24.

[2] 马利. 水貂养殖商机巨大[J]. 吉林畜牧兽医，2002（5）：27-28.

[3] 胡桂学.兽医微生物学实验教程[M].北京：中国农业大学出版社，2006：47-60.

[4] 杨沙沙，王喜仁，韩杰，等.美国CLSI抗菌药物敏感试验操作标准（2010年版）部分变更内容[J].中国感染控制杂志，2010（4）：303-304.

[5] R E 布坎南.伯杰氏细菌鉴定手册[K].北京：科学出版社，1984.

[6] 曹荣峰，田洪宇，王继芳，等.水貂细菌性疾病的病原学调查[J].经济动物学报，2008，12（1）：21-23.

[7] 张贵贤，史秋梅.水貂大肠杆菌病的诊断与防治[J].中国兽医杂志，2013，49（2）：45-46.

[8] 邢兰君.水貂大肠杆菌病的诊断与治疗[J].兽药与饲料添加剂，2008，13（3）：39.

[9] 李一经. 兽医微生物学[M].北京：高等教育出版社，2011.

[10] 倪金花.水貂大肠杆菌病的预防和治疗[J].养殖技术顾问，2014（1）：170.

安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2015，43（11）：127-128，131

责任编辑 陈玉敏 责任校对 况玲玲