桑螵蛸炮制前后蛋白质和多糖及脂类成分比较

贾坤静，艾 雪，贾天柱，2*，鞠成国,2

(1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600； 2.辽宁省中药炮制工程技术研究中心，辽宁 大连 116600)



桑螵蛸炮制前后蛋白质和多糖及脂类成分比较

贾坤静1，艾 雪1，贾天柱1，2*，鞠成国1,2

(1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600； 2.辽宁省中药炮制工程技术研究中心，辽宁 大连 116600)

目的：比较桑螵蛸炮制前后蛋白质提取率及多糖和脂类的含量差异。方法：采用考马斯亮蓝法测定桑螵蛸生制品蛋白质提取率，硫酸苯酚法和减重法分别测定桑螵蛸生制品中多糖和总脂的含量，抗坏血酸-钼蓝光度法测定磷脂的含量，并进行分析对比。结果：蛋白质提取率和多糖含量均为生品>盐炒品>蒸品，总脂含量为蒸品>盐炒品>生品，磷脂含量生品>蒸品>盐炒品。结论：桑螵蛸经过盐炒和蒸制后，蛋白质提取率以及多糖和磷脂含量均下降，总脂含量升高。

桑螵蛸；蛋白质；多糖；脂类

桑螵蛸是一味传统中药，有着悠久的药用历史。其味甘、咸、平，归肝、肾经，具有固精缩尿、补肾助阳的功效[1]。查阅中外文献后发现，关于桑螵蛸炮制前后的化学成分比较未见报道。炮制对中药的化学成分有重要影响，而炮制前后化学成分的变化必然引起中药药效的变化。有关桑螵蛸的蛋白类成分，国内研究较少。桑螵蛸的主要成分为蛋白质，约占桑螵蛸重量的58.5%[2]。桑螵蛸蛋白质中含有18种氨基酸，其中有8种是人体必需氨基酸[3]。现代研究已证实，多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、降血糖、抗凝血、抗血栓等作用[4]。磷脂是构成神经组织, 特别是脑脊髓的主要成分; 同时也是构成血球及其它细胞膜的重要物质。本实验对桑螵蛸炮制前后蛋白质和多糖以及脂类成分进行了比较，以期找出桑螵蛸炮制前后的成分差异，为桑螵蛸的临床应用提供依据。

1 材料

1.1 药材

桑螵蛸，采自大连庄河。经辽宁中医药大学王冰教授鉴定为“团螵蛸”(螳螂科昆虫大刀螂Tenodera sinensis Saussure的干燥卵鞘)。

蒸桑螵蛸：取桑螵蛸置于蒸锅中，加适量清水蒸至“圆气”后继续用文火蒸10min，取出，晾干，即得。

盐炒桑螵蛸：每100g桑螵蛸药材用30mL盐水(含2.5g盐)闷润1h，在100℃下文火炒10min，取出放凉，即得[2]。

1.2 试剂

小牛血清(纯度>98%,由sigma公司提供)； 无水葡萄糖(天津市光复精细化工研究所，批号：20130910)；考马斯亮蓝G-250；磷酸；石油醚；95%乙醇；活性炭；氯仿；正丁醇；苯酚；浓硫酸；磷酸二氢钾；钼酸铵；浓硝酸；抗坏血酸；过氧化氢；冰醋酸；酚酞；所用试剂均为分析醇，实验用水为超纯水。

1.3 仪器

电磁炉，RE-52CS旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；B-220恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-D(III)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；DFT-200手提式高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；Alpha4冷冻干燥机(Christ北京思达兴业仪器有限公司)；离心机；T6新世纪紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；HZ-A6002电子天平(瑞安市金讯贸易有限公司)；METTLER AE240型十万分之一分析天平(瑞士METTLER)；FA1004B型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；pH 计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；Multiskan-MK3型酶标仪(赛默飞世尔仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 考马斯亮蓝法测定蛋白提取率

2.1.1 标准曲线绘制 精密称取牛血清蛋白冻干粉10mg,加入适量水溶解，于10 mL容量瓶定容，得到浓度为1.031 mg/mL的对照品溶液。分别精密吸取牛血清蛋白对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于试管中，加水稀释至1mL。另取一试管加入1mL水作为空白对照管，各试管中加入考马斯亮蓝G-250显色剂4.0mL，混匀，室温下显色30min，于595nm处测定吸光度，以OD值为纵坐标，浓度为横坐标，得回归方程y=0.4184x+0.1688(r=0.999)。

2.1.2 Tris-cl缓冲液配制 称量60.5g Tris置于烧杯中，加入约400mL水，充分搅拌溶解，加入浓HCl调节pH=9，作为提取蛋白的缓冲液。

2.1.3 脱脂 取桑螵蛸生品、盐炒品和蒸品粉碎，过60目筛。称取桑螵蛸生制品粉末，以固液比1∶8(g/mL)加入石油醚，超声提取3次，每次30min，过滤，脱脂粉末干燥备用。

2.1.4 蛋白提取 精确称取生品、盐炒品、蒸品脱脂粉，每份5g。根据前期单因素试验优选条件，以固液比1∶15加入pH=9的Tris-cl缓冲液，在40℃的条件下提取18h，5 000r离心15min，取上清液，于595nm处测吸光度，根据标准曲线计算蛋白浓度。

2.1.5 结果 相同提取条件下的生品，盐炒品和蒸品的蛋白提取率均降低，桑螵蛸生制品蛋白提取率均值见表1。

表1 桑螵蛸生品蛋白提取率 (n=6)

2.2 硫酸苯酚法测定多糖含量

2.2.1 多糖的提取 称取“2.1.3”项所得桑螵蛸生制品脱脂粉各20g，加入10倍量的水回流煎煮1.5h，滤过，药渣再重复回流提取2次，合并3次所得滤液，旋转蒸发减压浓缩至30mL，加入160mL 95%乙醇，使混合后溶液的乙醇浓度达到80%。搅拌均匀之后放入4℃冰箱中一夜。第二天可见白色沉淀析出，3000r/min离心10min，弃去上清液，收集沉淀得粗多糖。

2.2.2 活性炭除色素 将粗多糖溶于纯水中，加入活性炭粉末搅拌后抽滤，反复几次，直到滤液变得澄清无色。

2.2.3 Sevage法除蛋白 将氯仿和正丁醇以5∶1的比例混合，将除去色素后的溶液倒入分液漏斗中，加入氯仿和正丁醇混合液，剧烈摇晃后静置分层，在水相和有机相的交界面可看到变性的蛋白质析出，弃去有机层和蛋白质层。如此反复多次，直到无蛋白层出现。

2.2.4 供试品溶液制备 将除去蛋白的粗多糖溶液于25mL容量瓶定容待测。

2.2.5 对照品溶液制备 取105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品，精密称定，加水溶解并于10mL容量瓶中稀释定容，配制成每1mL含葡萄糖1.081mg的对照品溶液。

2.2.6 选择测定波长 分别精密吸取对照品溶液和粗多糖溶液各1mL于试管中，加入1mL苯酚溶液和浓硫酸5mL，放入沸水浴中加热15min，取出冷却至室温，于200～800nm区间扫描，对照品与供试品均在490nm处有最大吸收峰，因此选择490nm为测定波长。

2.2.7 标准曲线绘制 精密吸取葡萄糖对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于干净试管中，补加水至1.0mL。然后分别加入1.0mL 5%的苯酚，再缓慢加入5.0mL浓硫酸,轻轻摇晃使其混合均匀。另取一只试管，加入1.0mL纯水，1.0mL 5%的苯酚和5.0mL浓硫酸作为空白对照，摇匀。置沸水浴中加热15min，取出冷却至室温，于490nm处测定吸光度值，以吸光度为纵坐标，糖浓度为横坐标，得到回归方程：y=0.5225x+1.8703，r=0.999。

2.2.8 精密度实验 取同一供试品溶液1.0 mL，按“2.2.7”项方法测定6次，计算得RSD=1.13%，表明精密度良好。

2.2.9 重复性实验 称取桑螵蛸生品粉末6份，按“2.2.1”项和“2.2.4”项方法制备供试品溶液并测定吸光度，得多糖平均含量为1.59%，RSD=1.35%。

2.2.10 稳定性实验 取桑螵蛸生品供试液，按“2.1.7”项方法测定吸光度，每5min测定1次，共测定6次。RSD=2.07%，表明桑螵蛸中多糖在30min内显色情况基本稳定。

2.2.11 加样回收率实验 精密称取已知含量的生品粉末6份，每份1g。按“2.2.1”项和“2.1.4”项方法制备供试品溶液，各加入葡萄糖标准品15.6mg，并按照“2.1.7”项方法测定吸光度，计算得多糖回收率为99.30%，RSD=2.33%。

2.2.12 结果 称取桑螵蛸生品、盐炒品、蒸品粉末按“2.2.1”项和“2.2.4”项方法制备供试品溶液并测定吸光度，根据标准曲线计算，得总多糖平均含量，见表2。

表2 桑螵蛸生制品多糖含量 (n=6)

2.3 减重法测定总脂含量

桑螵蛸生品、盐炒品和蒸品粉碎，过60目筛。称取生制品粉末各20g,以石油醚作为提取溶剂，固液比1∶8回流2h后过滤。共回流提取3次，合并滤液，旋转蒸发回收溶剂，减重法得总脂。桑螵蛸经炮制后总脂的含量均明显升高，平均含量如表3所示。

表3 桑螵蛸生制品总脂含量 (n=6)

2.4 抗坏血酸-钼蓝光度法测定磷脂含量

采用抗坏血酸-钼蓝光度法，用混酸湿法消化油样, 然后以硫酸调节反应酸度，加入钼酸铵溶液并以抗坏血酸作为还原剂，75℃水浴反应20min后在820nm处测定吸光度，计算磷脂含量[5]。

2.4.1 磷标准使用液配制 取105℃干燥至恒重的无水磷酸二氢钾，精密称定，加水溶解并于100mL容量瓶中稀释定容，配制成每1mL 含磷0.1mg的标准使用液。

2.4.2 标准曲线的绘制 按文献[5]测定标准曲线的条件和步骤测定出的标准曲线为：y=28.325x+0.0038(y为磷浓度，x为吸光度，r=0.999)。

2.4.3 样品消化及磷脂含量测定 称取“2.3”项所得桑螵蛸生品、盐炒品和蒸品油样各1.0g，按照文献[5]的方法进行消化并测吸光度，根据标准曲线计算得桑螵蛸生制品磷脂的含量。桑螵蛸经过炮制后磷脂含量较生品均有所下降，磷脂平均含量见表4。

表4 桑螵蛸生制品磷脂含量 (n=6)

3 讨论

桑螵蛸富含蛋白质，对治疗遗尿具有显著疗效。从中药成分与药效的相关性来看，桑螵蛸的药理作用很有可能与其所含的蛋白质有关。缓冲液法提取蛋白质简单易行，且提取效率较高，因此作者采用Tris-cl缓冲液作为提取试剂，来比较桑螵蛸生制品的蛋白提取率。实验结果表明， 桑螵蛸经加热炮制后蛋白提取率较生品有所下降，这与蛋白加热后变性，在缓冲液中溶解度减小有关。

多糖作为一种生物活性物质, 在很多方面发挥着不可替代的作用, 在医学方面应用也越来越广泛。近年来，随着分子生物学的兴起和发展, 多糖在生命过程中所起的重要作用也被越来越深入地发现和挖掘出来。研究表明，桑螵蛸对免疫器官有增强作用[ 6 ]，能提高机体的免疫机能。桑螵蛸盐炒品和蒸品的多糖含量均低于生品，说明盐炒和蒸制会导致桑螵蛸多糖含量降低。

桑螵蛸经炮制后，盐炒品和蒸品的总脂含量都远远大于生品，这是由于高温可以破坏细胞,有利于脂类从细胞中出来。此外，脂蛋白在昆虫体内普遍存在，高温可使蛋白质变性，脂类聚集，降低了黏度和表面张力，更利于脂类的释放。

磷脂具有重要的生理意义, 它是细胞中脂肪酸新陈代谢的中间产物，是构成细胞生物膜脂双层的基本骨架，也是构成各种脂蛋白的主要组成成分，大脑和神经细胞的组成中磷脂必不可少。磷脂能调节人体代谢、消除大脑疲劳、提高人体记忆力、防止动脉粥样硬化。桑螵蛸中磷脂含量丰富, 有磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、磷脂酰肌醇及溶血磷脂酰胆碱等[7]。抗坏血酸-钼蓝分光光度法显色快速, 操作简便,不需要特殊试剂，且颜色稳定,是一种快速、安全、准确测定磷含量的方法[8]。本实验采用抗坏血酸-钼蓝分光光度法测定桑螵蛸生制品中的磷脂含量，结果稳定可靠。磷脂不耐热，在高温条件下极不稳定，易发生分解。桑螵蛸经过盐炒和蒸制的高温后，磷脂含量下降，盐炒品和蒸品均较生品低。

查阅历年关于桑螵蛸的文献, 其化学成分方面多集中在粗成分的研究，关于生品及炮制品的对比研究则是少之又少。中药炮制对于中药的化学成分和药理作用有显著影响。随着科学技术的发展和人们对药物研究认识的深入，对桑螵蛸炮制前后化学成分和药理作用的进一步研究可以为临床用药提供参考，具有重要意义和广阔的发展前景。

[1] 国家药典委员会.中国药典[M].北京：中国医药科技出版社,2010:281-282.

[2] 张保国,张大禄.动物药[M].北京:中国医药科技出版社,2003: 523-529.

[3] 杨会全,程地芸,叶玉兰.3种桑螵蛸的氨基酸含量分析[J].基层中药杂志,1999,13(3):16-17.

[4] 吴笳笛.多糖的作用及其研究进展[J].沈阳师范大学学报：自然科学版,2008(2):221-223.

[5] 万楚筠,黄凤洪,李文林.抗坏血酸-钼蓝光度法测定油脂中磷脂含量的研究[J].中国油脂,2006(4):46-49.

[6] 谭正怀,雷玉兰,张白嘉,等.桑缥峭的药理比较研究[J].中国中药杂志,1997，22(8):496.

[7] 许益明,王永珍.桑螵蛸磷脂及游离氨基酸成分分析[J].中药材,1989,12(8):24-25.

[8] 黄城,周燕,曾淦宁,等.抗坏血酸-钼蓝分光光度法测定海藻中磷的研究探讨[J].海洋环境学,2009(1):76-78.

(责任编辑：余 婷)

Comparision of Protein and Polysaccharide and Lipids in Antis Egg-case before and after Processing

Jia Kunjing1,Ai Xue1,Jia Tianzhu1,2*,Ju Chengguo1,2

(1.Pharmacy College，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China; 2.Chinese Materia Medica Processing Engineering Center of Liaoning Province, Dalian 116600, China)

Objective:Compare polysaccharide and lipids in antis egg-case before and after processing.Methods:Use phenol sulfuric acid method and weight loss method to determine the content of polysaccharide and total fat in antis egg-case before and after processing,and ascorbic acid-molybdenum blue method for determining the content of phosphatide.Results:The content of protein and polysaccharide from high what is the non-processde sample ,the salt-fride sample and the water-steamde sample. The content of total fat from high what is the water-steamde sample,the salt-fride sample and the non-processde sample.The content of phosphatide from high what is the non-processde sample,the water-steamde sample,the salt-fride sample.Conclusion:The content of polysaccharide and phosphatide are declined after processing,and the content of total fat is rised.

Antis Egg-case;Protein;Polysaccharide;Lipids

2015-07-15

国家中医药管理局行业专项(201107007)

贾坤静(1989-)，女，辽宁中医药大学硕士研究生，研究方向为中药炮制原理。

贾天柱(1951-)，男，辽宁中医药大学教授、博士生导师，研究方向为中药炮制原理。

R284.1

A

1673-2197(2015)23-0015-03

10.11954/ytctyy.201523007