肾病患者血浆代谢组学分析前样品处理方法优化

赵 静，关 欣，包永睿，王 帅，孟宪生*，郑红光*

(1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连116600；2.中国人民解放军沈阳军区总医院，辽宁 沈阳 110016)



肾病患者血浆代谢组学分析前样品处理方法优化

赵 静1，关 欣2，包永睿1，王 帅1，孟宪生1*，郑红光2*

(1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连116600；2.中国人民解放军沈阳军区总医院，辽宁 沈阳 110016)

目的：对代谢组学分析前慢性肾病患者血浆样品的处理方法进行优化。方法：采用HPLC/TOF-MS技术分别对60例慢性肾病患者及30例健康志愿者的血浆处理方法进行优化研究。结果：实验结果显示，采用甲醇沉淀蛋白质对慢性肾病患者及健康人血浆均可达到较好的除蛋白效果，并且可最大限度地保留血浆中的待测组分；用80%乙腈作为复溶溶剂可最大限度地保留血浆中的待测组分。结论：建立了采用HPLC/TOF-MS技术对代谢组学分析前样品进行处理优化的方法，为研究慢性肾病患者血浆代谢组学奠定基础。

慢性肾病；血浆；液质联用；样品处理

慢性肾病是指由各种病因使肾单位发生进行性破坏，不能充分排出代谢废物和维持内环境稳定，导致体内出现代谢废物潴留及水、电解质与酸碱平衡紊乱，并伴有尿量和尿质改变以及肾脏内分泌功能障碍的疾病。代谢组学是通过比较对照组和实验组代谢物的不同，以寻找其代谢谱差异的一种研究方法。通过对由疾病诱导产生的代谢产物变化进行分析，可帮助了解病变过程和机体内代谢途径[1-2]，寻找新的疾病生物标志物，同时辅助临床诊断和治疗。

在代谢组学研究过程中，样品前处理环节是至关重要的，影响诊断结果的可靠性和准确性。在样品制备过程中，在保证实验数据真实、可靠的基础上，需要在样品前处理时尽量除去其含有的蛋白质并最大限度地保留全部样品信息。本实验在液质联用的基础上，建立慢性肾病血浆样本处理条件的考察方法，并首次使用Agilent MPP12.1软件的MFE功能进行化合物提取，以化合物提取数量为考察指标，为今后运用代谢组学方法探讨慢性肾病患者与健康人血浆代谢差异物，并根据代谢物的不同指导慢性肾病的临床用药奠定基础。

1 研究对象

所选病例主要来源于沈阳军区总医院已获知情同意的门诊及住院患者，正常对照组为来自沈阳军区总医院的健康自愿者。其中慢性肾病患者血浆样本60例，正常人血浆样本30例。

2 仪器与试剂

2.1 仪器

高效液相色谱仪(Agilent1100，配有DAD检测器及自动进样器)，QF3800氮气吹干仪(北京华盛谱信仪器有限责任公司)，H1650-W离心机(湖南湘仪实验仪器开发有限公司)，TDZ4-WS低速台式离心机(湖南湘仪实验仪器开发有限公司)，-80℃低温冰箱(NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC公司)，Milli-Q超纯水系统(Millipore，France)，20～200μL和200～1 000μL移液枪(法国吉尔森公司)，TOF-MS(Agilent TOF G1969A，配有ESI电离源接口)，VORTEX-5涡旋混合器(海门市其林尔仪器制造有限公司)。

2.2 试剂

色谱级乙腈、甲醇(德国Merck公司)，色谱级甲酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)，超纯水(18.2 MΩ) 由本实验室Milli-Q超纯水系统(Millipore，France)制备，其他试剂均为分析纯。

3 方法与结果

3.1 色谱条件

色谱柱为Agilent Poroshell 120 SB-C18column(100mm×4.6mm，2.7μm)，流速为1mL·min-1，分流比为3∶1，柱温为45 ℃，流动相为A：0.1 %甲酸水溶液，B：乙腈，梯度洗脱条件见表1。进样量为4μL，进样高度为4mm。

3.2 质谱条件

电喷雾离子源(Dual ESI)，采用正离子模式检测。用350℃气体干燥，流速为9L·min-1；毛细管电压为4 000V，雾化器压力为45psig，Skimmer 为65V；碎裂电压为125V，OCT 1RF Vpp为250V；采用质心模式采集，速率为1.5Spectra/s，m/z50～1050；采用校正混合溶液(Agilent，USA，m/z=121.050 873，922.009 798)作为锁定质量(Lock mass)。

表1 梯度洗脱条件

3.3 血浆样品处理方法优化

3.3.1 沉淀蛋白溶剂考察 LC-MS进样前，要除去样品中含有的蛋白质，不同溶剂对蛋白质的去除效果有所不同，沉淀蛋白质的同时还要尽量保存组分中的其他物质，并且使之能充分地溶解在溶剂中。

(1)混合血浆制备：分别精密吸取慢性肾病患者及健康人所有血浆样本各100μL于样品管中，混匀，备用。

(2) 供试品溶液制备：分别精密吸取100μL混合血浆样品各10份于2mL离心管中，分别精密加入60%、70%、80%、90%、100%乙腈和60%、70%、80%、90%、100%甲醇各400μL，涡旋3min，4 ℃下15 000 r·min-1离心15min，用移液枪吸取上层清液，采用氮气吹干仪吹干后分别精密加入相应提取溶剂各100μL，备用。

实验结果显示，采用甲醇沉淀蛋白质可达到较好的除蛋白效果，并且可最大限度地保留血浆中的待测组分，结果见表2。

3.3.2 复溶溶剂考察 血浆溶液经蛋白沉淀后，吸取上层清液，氮气吹干后需再进行复溶。复溶溶剂极性的大小是影响被提取成分是否能够完全溶解的关键因素，假设甲醇沉淀血浆中蛋白质时，血浆含水量以100%计，100μL血浆加入甲醇400μL，相当于蛋白质沉淀溶剂为80%甲醇，为保证样品能完全溶解，现对样品复溶溶剂进行考察。

精密吸取100μL混合血浆样品10份于2mL离心管中，分别精密加入甲醇400μL，涡旋3min，4℃下15 000r·min-1离心1min，用移液枪吸取上层清液，氮气吹干仪吹干后，分别精密加入60%、70%、80%、90%、100%乙腈和60%、70%、80%、90%、100%甲醇各100μL。实验结果显示，以80%乙腈作为复溶溶剂可最大限度地保留血浆中的待测组分，结果见表3。

表2 沉淀蛋白质溶剂用量考察结果 (μL)

表3 复溶溶剂用量考察结果 (μL)

3.3.3 冻融稳定性考察 对同一份血浆样品分别进行冻融1、2和3次处理，每组重复处理两次，考察冻融循环后样品的稳定性，标记为1～6，样品处理方法如上。经过不同冷冻循环处理后的样品，测定其所含化合物数量，并计算RSD值，均小于15%。结果表明，样品经不同冻融循环后，不会引起统计学上的差异，样品冻融稳定性良好。

3.3.4 重复性考察 分别精密吸取慢性肾病及健康人血浆样品各6份，每份各100μL，精密加入甲醇400μL，涡旋3min，4℃下15 000r·min-1离心15min，用移液枪吸取上层清液，氮气吹干仪吹干后，精密加入80%乙腈100μL，涡旋3min，4℃下15 000 r·min-1离心15min，吸取上清，即得样品溶液。测定所含化合物数量，并计算RSD值，均小于15%，结果见图1和图2。结果表明，该血浆样品处理方法重复性良好，可用于肾病血浆代谢组学研究。

图1 慢性肾病患者血浆HPLC-TOFMS总离子流

图2 健康人血浆HPLC-TOFMS总离子流

4 结论

在代谢组学研究中，样品制备过程必须要遵循以下几项原则：首先要尽量简化处理步骤以使样品中蛋白质被完全除去，并能达到各组分相互分离的效果；在保证样品各组分相对浓度稳定的同时尽可能避免样品中待测物流失；处理方法应具有良好的重复性。因此本实验设法在分析样品前将血浆中的蛋白质尽可能地除去，再对其进行LC-MS分析。在沉淀蛋白质的同时，要最大限度地保留血浆中的小分子化合物，使其充分溶解在有机溶剂中，尽量减少待分析组分因蛋白沉淀而造成损失。沉淀蛋白质的过程尤为重要，需对沉淀溶剂进行考察。本研究对代谢组学实验血浆样品的制备方法及其测定条件进行了选择和优化，得到全面精确、可靠的实验数据。

本研究对血浆前处理方法的沉淀溶剂及复溶溶剂进行了考察，结果表明该方法有效、可行。实验结果显示，采用甲醇沉淀蛋白质对慢性肾病患者及健康人血浆均可达到较好的除蛋白效果，并且可最大限度地保留血浆中的待测组分；用80%乙腈作为复溶溶剂可最大限度地保留血浆中的待测组分。此外，对冻融稳定性及重复性进行考察时发现，在3次冻融循环之内，提取的化合物数量没有统计学差异，表明冻融稳定性效果良好；分别对慢性肾病组及健康组患者血浆样品进行重复性考察，结果显示该方法重复性良好。

综上所述，该方法操作简单，尽可能保留了血浆样品中的小分子化合物，符合代谢组学高通量研究的基本要求。在寻找慢性肾病患者与健康人血浆中差异物的基础上，进一步探讨慢性肾病患者的发病机制，为今后临床治疗慢性肾病奠定基础。

[1] TAYLOR J,KING R,FIEHIN O.Application of metabolomics to plant genotype discrimination using statistics and machine learning[J].Bioinformatics,2002,18(10):S241-S248.

[2] CHEN JING,LU XIN,XU GUOWANG,et al.A metabonomics approach based on liquid chromatography-mass spectrometry:from metabolic profiling to potential biomarker[J].Science in China Series B Chemistry,2009,39(17):1268-1276.

(责任编辑：尹晨茹)

Optimization of Disposal Method of Treated Plasma Samples Before Analysis of Metabolism in Chronic Kidney Disease Patients

Zhao Jing1,Guan Xin2,Bao Yongrui1,Wang Shuai1,Meng Xiansheng1*,Zheng Hongguang2，*

(1.Pharmaceatic of Liaoning Univresity of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600,China;2.General Hospital of Shenyang Military Region of PLA,Shenyang 110016,China)

Objective:Patients with chronic kidney disease on plasma sample preparation method metabolomics analysis before optimization.Methods:HPLC/TOF-MS technology for 60 cases of patients with chronic kidney disease and 30 healthy volunteers plasma research.Results:Experi-mental results show that the protein precipitation with methanol,chronic kidney disease patients and healthy addition to human plasma proteins can achieve better results， and can maximize the retention of analytes in plasma,with 80% acetonitrile as a solvent reconstitution can be plasma maximize the retention of analytes.Conclusion:the established for metabonomics optimization method for sample treatment before analysis using HPLC/TOF-MS technology.To lay the foundation for the study of plasma metabonomics．

Chronic Kidney Disease; Plasma; LC-MS;Sample Preparation

2014-09-10

赵静(1988-)，女，辽宁中医药大学硕士研究生，研究方向为药物分析及慢性肾病代谢组学。

孟宪生，男，博士，辽宁中医药大学教授，研究方向为中药质量分析，E-mail:mxsvvv@126.com；郑红光，男，博士，中国人民解放军沈阳军区总医院主任医师，研究方向为肾病临床诊疗，E-mail:phd528@163.com。

Q936

A

1673-2197(2015)02-0031-03

10.11954/ytctyy.201502012