徐长卿药材中丹皮酚超声提取工艺研究

2015-04-26李见春张文静

亚太传统医药 2015年2期

关键词：丹皮药材甲醇

朱娜，李见春，张文静，王秀

(蚌埠医学院药学系，安徽蚌埠 233030)

徐长卿药材中丹皮酚超声提取工艺研究

朱娜，李见春*，张文静，王秀

(蚌埠医学院药学系，安徽蚌埠 233030)

目的：筛选超声提取徐长卿药材中丹皮酚的最佳工艺。方法：应用超声提取法，采用L9(34)正交试验，以丹皮酚含量为指标，考察料液比、超声温度、超声时间3个因素对提取工艺的影响，采用HPLC法测定丹皮酚含量。结果：丹皮酚的最佳提取工艺为超声温度50℃，超声时间20min，料液比1∶10。结论：优选的最佳提取工艺稳定可靠，重复性好，可最大限度地提取徐长卿药材中的有效成分。

丹皮酚；超声提取；正交试验；HPLC

徐长卿为我国传统中药材，始载于《神农本草经》，为萝摩科植物徐长卿的根及根茎或带根全草。其性温、味辛，归肝、胃经，具有祛风化湿、止痛止痒、解毒消肿之功效，临床广泛用于湿疹、荨麻疹、接触性皮炎等皮肤科疾病及各类疼痛、跌打损伤等症的治疗[1]。丹皮酚是徐长卿的主要活性成分。大量研究表明，丹皮酚具有显著的抗炎、抗变态反应作用，对脾脏、胸腺等免疫器官及淋巴细胞、单核细胞等免疫分子均具有显著的调节作用。此外，丹皮酚还可抑制组胺、5-羟色胺、缓激肽及花生四烯酸等炎症介质的释放，对豚鼠皮肤血管炎性反应、大鼠被动皮肤过敏反应等均具有显著的抑制作用[2-3]。王玫等[4]采用RT-PCR法考察丹皮酚的抗皮肤炎症作用，为其作用机制提供参考依据。

随着丹皮酚研究的日益深入，其提取工艺受到越来越多的关注。本实验在大量查阅文献的基础上，采用超声提取[5]-水蒸气蒸馏法[6]提取丹皮酚，通过正交试验对丹皮酚提取工艺进行优化，并建立了一种简便、经济的高效液相色谱法测定徐长卿药材中的丹皮酚含量，为进一步开发利用该活性成分提供参考。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

KQ5200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；LC-20AD二元高压梯度高效液相，SPD-15C紫外检测器，DT-230A柱温箱(日本岛津公司)；FC204型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；Milli-Q Advantage A10纯水机(密理博(上海)贸易有限公司)；XW-80A微型涡旋混合仪(上海沪西分析仪器厂)；TG16-W微量高速台式离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；HH-6数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)。

1.2 试剂

徐长卿为山东产中药材，经鉴定为萝摩科植物徐长卿的干燥根和根茎；丹皮酚原料药(购于武汉大华伟业医药化工有限公司，批号：20130327，供含量测定用，纯度为99.2%)；甲醇为色谱纯，水为双蒸水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Kromasil C18Column(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇∶水=75∶25，流速为1.0mL/min，检测波长为274nm，柱温为30℃，进样量为20μL。在上述色谱条件下，丹皮酚与其他组分可达到基线分离，溶剂无干扰，见图1。

2.2 对照品溶液制备

精密称取丹皮酚对照品2.8mg，置于25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为111μg/mL的丹皮酚对照品储备液。

2.3 供试品溶液制备

根据预试验结果，最终确定供试品溶液制备方法为取徐长卿粗粉约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，摇匀，称定重量，超声处理30min后，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液1mL置于10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4 标准曲线制备及线性关系考察

精密量取储备液适量，用甲醇定容成丹皮酚系列对照品溶液，浓度分别为0.054、0.217、0.434、1.74、3.47、13.89、27.78μg/mL。分别精密吸取上述系列溶液20μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行分析，记录色谱图和峰面积积分。以浓度为横坐标，峰面积积分为纵坐标，得回归方程为Y=82 654X-367.47，R2=0.999 9，丹皮酚在0.054～27.78μg/mL浓度范围内与其峰面积积分呈良好的线性关系。

图1 徐长卿中丹皮酚HPLC色谱

2.5 精密度试验

取1.75μg/mL 丹皮酚对照品溶液20μL，连续进样6次，按“2.1”项下色谱条件测定，计算得丹皮酚峰面积RSD为1.3%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

分别于0、2、4、8、12h精密吸取常温放置的同一供试品溶液20μL，按上述色谱条件进样测定，记录峰面积积分，结果表明丹皮酚峰面积RSD为1.59%，供试品溶液在常温下放置12h内基本稳定。

2.7 加样回收率试验

精密称取已知丹皮酚含量的徐长卿供试品9份，分为3组，每组3份。3组样品分别精密加入低、中、高已知含量的丹皮酚对照品溶液，按“2.3”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，每份样品重复3次，记录峰面积，并计算平均回收率，得平均回收率为98.18 %，RSD 为1.85%。

2.8 正交试验优化提取工艺

称取徐长卿粗粉40g，置于圆底烧瓶中，水浴40℃，浸泡2h，进行超声提取，水蒸气蒸馏。根据单因素试验及超声清洗器的功能范围，本实验选择甲醇为固定提取溶剂，以超声温度、超声时间、料液比为考察指标，按照L9(34)正交表进行试验，因素水平表见表1，正交试验结果见表2，方差分析见表3。

由上述各表结果可知，以丹皮酚含量为指标，A、B、C因素对超声-水蒸气蒸馏提取结果影响大小依次为B>A>C，即超声提取温度为最主要影响因素，其他因素对提取结果有些许影响。综上可知，最佳提取工艺条件为A3B2C1，即料液比为1∶10，超声温度为50℃，超声时间为20min。

表1 因素水平

表2 L9(34)正交试验设计

表3 正交试验方差分析

注：F0.05(2,2)=19.00

3 讨论

本实验参照文献[7-8]，选用甲醇为提取溶剂，通过正交试验得出A3B2C1为最佳方案。方差分析表明B因素对丹皮酚得率具有极显著性影响，A因素有显著性影响，C因素影响不显著，与文献中记载丹皮酚超声提取法的主要影响因素为超声温度相符合[9]。结果显示最佳超声时间为20min，40min时含量略有下降，原因是时间过短，丹皮酚还未充分溶出，时间过长，一些热敏感组分会被破坏。此外，溶剂挥发也可能导致丹皮酚含量下降。丹皮酚熔点较低、极易挥发、水溶性差的理化性质也可能导致超声时间过久而对其结构造成破坏。

丹皮酚是固体针状结晶，提取方法较多[10]，其中有机溶剂浸出法可缩短提取时间，但引入杂质较多；蒸馏-大孔树脂法、超临界CO2流体萃取法对仪器有特殊要求且成本较高，耗时较长。选用超声提取-水蒸气蒸馏法可获得比常规方法更佳的提取效果。超声波具有穿透力强、选择性高、有效成分溶出快速等优点，可提高浸出率、缩短提取时间，同时可避免高温对成分稳定性的影响。

本实验优选了徐长卿药材中丹皮酚的超声提取工艺，方法简单易行，重复性好，为其工业化大生产奠定了基础。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].一部.北京:中国医药科技出版社,2010:268.

[2] 冯鑫,郑洋.徐长卿抗过敏功效综述[J].山西中医,2006,22(1):45-46.

[3] 孙言才,沈玉先,孙国平.丹皮酚的主要药理活性研究进展[J].中成药,2004,26(7):579-582.

[4] 王玫,刘继勇,韩盈等.丹皮酚对TNF-α诱导真皮成纤维细胞MMP-9mRNA及细胞因子表达的影响[J].中国药理学通报,2009,25(4):458-461.

[5] 秦梅颂.超声提取技术在中药中的研究进展[J].安徽农学通报,2010,16(13):54-56.

[6] 李玉贤,万炎,陈晓岚.牡丹皮中丹皮酚的提取方法研究[J].河南中医学院学报,2007,22(2):37-38.

[7] 闫晗,刘静,孙锐,等.高效液相色谱法测定徐长卿药材、丹皮酚注射液及生物样品中丹皮酚含量[J].亚太传统医药,2012,8(5):14-16.

[8] 黄丽丹.徐长卿中丹皮酚含量测定方法研究[J].安徽医药,2008,12(7):599-600.

[9] 朱琳琳,李玉贤.丹皮酚超声提取工艺研究[J].中医学报,2011,26(6):713-714.

[10] 王立,侯世祥等.牡丹皮药材的最适提取工艺研究[J].中国中药杂志,2005,30(8):569-571.

(责任编辑：尹晨茹)