超高效液相串联质谱快速定性分析大蓟

彭海博，吴 霞，张 宇，冯毅凡

(广东药学院 中心实验室，广东 广州 510000)



超高效液相串联质谱快速定性分析大蓟

彭海博，吴 霞，张 宇，冯毅凡*

(广东药学院 中心实验室，广东 广州 510000)

大蓟是治疗高血压、各种出血和炎症的一种中药，但目前鲜有关于其有效成分的报道。通过UPLC/Q-TOF建立一种快速高效的方法对大蓟所含成分进行分析。基于精确分子量、计算分子成分，结合二级质谱数据及相关文献报道，发现并确定29种成分结构，包括黄酮、黄酮糖苷、异黄酮、有机酸和蒽醌类化合物。其中斑鸠菊酸、叔丁基羟基茴香醚、二氢辣椒素、大黄蒽醌和紫杉叶素等为首次在大蓟中发现并讨论其ESI源中的二级质谱裂解规律，黄酮在ESI源中脱去CO和H2O的二级裂解规律也初次被阐述。

大蓟；二级质谱碎片；超高效液相-Q-TOF-MS；快速分析

大蓟是一种多年生草本植物，广泛分布于中国、日本和朝鲜。在传统中药中，大蓟因具有抗出血和利尿的作用而被广泛应用于外伤性出血、高血压和炎症的治疗[1]。刘素君等[2-4]研究发现大蓟具有抗肿瘤、抗氧化等作用，同时对糖尿病有一定治疗作用。

超高效液相串联Q-TOF技术(UPLC/Q-TOF-MS)是一种快速、灵敏、精确的非靶向分析方法，通过精确分子量和二级质谱裂解确定分子式和分子结构。相比于传统分析方法，如高效液相串联低分辨率质谱，UPLC/Q-TOF-MS具有更好的分离效果和更高的分辨率。因此，其更适用于中药中未知成分的快速分析和结构鉴定。近十年内，大蓟中已被鉴定的成分有33种，大蓟甲醇提取物成分的快速分析研究尚未见报道。因此，有必要建立一种从大蓟提取液中直接进行成分分析的快速方法。

本研究建立了UPLC/Q-TOF法快速简便分析大蓟中的成分，共鉴定出29种成分。其中一些二级裂解规律为第一次在ESI源中被报道，首次在大蓟甲醇提取液中发现的是斑鸠菊酸、叔丁基羟基茴香醚、二氢辣椒素、大黄蒽醌和紫杉叶素。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

乙腈(色谱纯)和甲醇(色谱纯)均购自Merck公司(德国，达姆施塔特)。甲酸(色谱纯)购自DIMA(美国，弗吉尼亚州)。亮氨酸-脑啡肽购自Sigma公司(美国，密苏里州)，大蓟购自广州至信药材公司，全草经过广东药学院刘基柱教授鉴定保存于本实验室，编号：2001304081017。

1.2 样品制备

取大蓟全草1.0g切碎，加入甲醇-水(1∶1)10mL 60℃下水浴1h，超声提取2次，每次1h。提取液经10 000rpm高速离心2min，微孔滤膜(0.22μm)过滤，进样量为5μL。

1.3 色谱条件

超高效液相为Waters公司Acquity系统，配置2元泵，真空脱气并自动进样。色谱柱为Waters公司BRH分析柱(50mm×2.1mm，1.7μm)，流速为0.3mL/min，柱温为25℃，流动相为为乙腈(B)-0.1%甲酸水(A)[5]。梯度洗脱：0～4min，5%～20% B；4～10min，20%～30% B；10～11min，30%～45% B；11～16min，45%～65% B；16～17min，65%～100% B。

1.4 质谱条件

毛细管电压为3 000V，锥孔电压为30V，源温为100℃，脱溶剂温度为350℃，锥孔气流为50L/h，脱溶剂气体为600L/h，碰撞气体为氩气，碰撞能量为25～45V，质谱数据采集范围为m/z 50～1 000，采用亮氨酸-脑啡肽作为参考标准溶液(正离子模式下[M+H]+=556.2771，[M+H]-=554.2615)。

2 结果

2.1 UPLC/Q-TOF分析条件优化

通过预实验，将UPLC最佳流速设定为0.3mL/min[6]。通过对甲醇-水、乙腈-水、乙腈-异丙醇流动相体系进行考察，同时考虑保留时间、加和离子和分离效果等因素，最终选择乙腈-水(含0.1%乙酸)体系进行梯度洗脱。由于不同离子模式对离子对有竞争性抑制作用，实验结果显示负离子模式灵敏度和信噪比均较高。

2.2 UPLC/O-TOF分析

本次实验中共有29个成分被鉴定出来(见表1、表2)，包括黄酮、黄酮糖苷、异黄酮、有机酸、酚酸和蒽醌类化合物。本研究中鉴定的成分已经通过Sci-finder数据库确认。

2.2.1 黄酮和黄酮糖苷裂解 黄酮类在一级质谱中只有母离子存在，无法鉴定其分子结构，但黄酮类的二级质谱行为可确定B环和C环上的羟基数量和位置。因此，将黄酮类的一级质谱与二级质谱相结合可准确鉴定出其分子结构。

本实验中，毛地黄酮在负离子模式下产生了m/z 199的特征峰，可能是由于A环和B环的作用，导致C2H2O和CO2基团连续脱去[7]。负离子模式下C环脱去一个O原子，但是该现象并未在芹黄素和槲皮素中发现，可能是由于3-位没有羟基取代，也可能是B环上羟基的供电子作用破坏了环上的共轭结构，从而降低了C环的稳定性，导致m/z 269特征碎片离子的产生。在正离子模式下产生了m/z 241的特征峰，是由于C环脱去CO2，B环脱去一分子H2O[8]。此外，由于1，3B+裂解容易脱去1分子H2O，所以 1，3B+会产生m/z 117的碎片离子。

芹黄素的特征碎片是m/z 153和119。 C环由于失去一个CO基团而紧缩，产生了m/z 243的碎片。m/z 243的碎片可进一步裂解失去CO和H2O，产生新的碎片m/z 197。特征碎片m/z 153可通过脱去一分子H2O而产生新的特征碎片m/z 171。

槲皮素由于在3-位上有羟基取代，1，3A+和1，2A+都会产生特征例子m/z 179。1，2A+容易脱去CO基团，故m/z 151是槲皮素的主要碎片诊断离子。同时，异黄酮类相对于黄酮类需要更高的碰撞能量才能得到特征碎片离子[9]。

B环上的羟基取代程度可影响黄酮糖苷的质谱裂解行为。B环上羟基越多，在低能量撞击下脱去糖苷键碎片的强度越高。毛地黄酮-7-O葡萄糖苷在B环上有一个羟基取代，比蒙花苷-7-O芸香糖苷和芹黄素-7-O吡喃糖苷产生的脱糖苷碎片丰度更高。此外，糖苷键的取代位置对碎片也有影响，槲皮素-3-O芸香糖苷在B环上有两个羟基取代，但是相比于毛地黄酮-7-O葡萄糖苷则需要更高的碰撞能量才能得到黄酮碎片离子。羟基和O-糖苷键是供电子基团，由于定位效应和共轭效应，B环上未被取代和3-位上有供电子基团的结构需要更高的碰撞能量。因此，当毛细管电压和锥孔电压分别设定在3 000V和30V时，槲皮素-3-O芸香糖苷的槲皮素残基可在一级质谱中被找到[10]

2.2.2 新分离成分结构特征 首次在大蓟甲醇提取液中发现的是斑鸠菊酸、叔丁基羟基茴香醚、二氢辣椒素、大黄蒽醌和紫杉叶素。由于存在离子对竞争性抑制，大黄素-甲醚、二氢辣椒素、叔丁基茴香基醚仅存在于正离子模式下，斑鸠菊酸、半夏酸、紫杉叶素仅存在于负离子模式下。

大黄素-甲醚的主要碎片离子为脱落了一个甲基基团的m/z 270，其结构是通过共轭作用保持稳定性的。此外，由于3-位CO基团的脱落，产生了m/z 242的碎片离子[11]。

二氢辣椒素的主要碎片离子m/z 290与文献报道的主要碎片离子m/z 137并不一致[12]，碎片离子m/z 136进一步失去一个CH2基团，碎裂成为m/z 122的碎片离子，这个裂解是ESI源中没有发现过的。二氢辣椒素的主要裂解途径是通过N-C键的断裂，其主要碎片离子(m/z 137)也是由于N-C键断裂而产生的[12-13]，可能的机制见图1。

图1 正离子模式下二氢辣椒素裂解途径

峰号保留时间电离模式质荷比(m/z)计算值(m/z)浓度(ppm)分子式MS/MS(m/z)分子名称14.50[M+H]+463.0880463.08770.6C21H18O12287,153,135Luteolin7-O-glucuronide25.24[M+H]+447.0929447.09270.4C21H19O11271,153,1194H-1-Benzopyran-4-one,3-(β-D-glucopyranosyloxy)-5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-35.68[M+H]+275.0923311.0933275.0925311.0919-0.74.5C15H14O5C18H14O5257,239,183,171,143,128147,166,178,187,190,233,266epi-Afzelechin6-Desoxyjacareubin47.20[M+H]+287.0557287.0556-0.3C15H10O6241,153,135,117Luteolin57.35[M+H]+593.1823593.1870-7.9C28H32O14285Linarin-7-O-rutinoside68.72[M+H]+308.2230308.22261.3C18H29N1O3290,262,206,192,179,136,122Dihydrocapsaicin78.86[M+H]+271.0609271.06061.1C15H10O5243,225,171,153,119Apigenin810.02[M+H]+181.1206181.122912.7C11H16O2137,105ButylatedHydroxyanisole911.19[M+H]+259.0975259.09701.9C15H14O4243,225,211,143,131O-Desmethylangolensin1011.88[M+H]+403.2070403.20802.5C18H30N2O8224,152,117,105Tyrosine1112.03[M+H]+285.0768285.07631.8C16H12O5270,242,153,133Physcion

表2 负离子模式下成分鉴定

叔丁基茴香基醚的质谱信息可通过Wiley数据库进行鉴定，m/z 137是其主要的碎片离子，但仍可以进一步失去一个CH4O基团，碎裂为m/z 105形成另一个主要碎片离子。

斑鸠菊酸是第一次在ESI-MS中被报道，其主要碎片为m/z 277(M-H2O-H-)和m/z 195 (M-C6H12O-H-)。半夏酸的裂解方式和斑鸠菊酸类似。

紫杉叶素的母离子相继脱去一个二苯基基团和一个C3O3H5基团，产生了m/z 241和m/z 151碎片离子。

3 结论

应用UPLC/Q-TOF-MS 技术对大蓟甲醇-水提取物进行快速分析，在17min内成功鉴定出29种成分，其中5种化学成分为首次在大蓟中发现。本文阐明了电喷雾质谱中大蓟各成分的裂解规律，并总结了大蓟中各类成分的主要碎片离子和异黄酮类中[1，2A+-CO+H]+可作为3-位上是否有羟基取代的诊断离子。综上所述，UPLC/Q-TOF-MS技术可应用于大蓟成分的快速分析和结构鉴定。

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A Rapid Ultraperformance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometric Method for Qualitative Analysis of Cirsium japonicum

Peng Haibo, Wu Xia, Zhang Yu, Feng Yifan*

(Central Lab of Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510000,China)

Cirsium japonicum is a perennial medicinal plant. A better understanding of this herb requires the detection of new potentially useful compounds and analysis of their application. A rapid and sensitive method for identification of the constituents of C. japonicum was developed, which employed ultraperformance liquid chromatography coupled with electrospray ionization-tandem quadrupole high resolution time-of-flight mass spectrometry (UPLC/Q-TOF-MS). Using this approach, 29 compounds were identified and tentatively characterized, in a period of 17min. These compounds included flavonoids, flavone glycosides, isoflavonoids, organic acids, phenolic acids, and anthraquinones. Among them, vernolic acid, butylated hydroxyanisole, physcion, and taxifolin have been reported for C. japonicum for the first time, and their fragmentation behavior upon electrospray ionization has been discussed. Unusual H2O and CO loss in flavonoids was characterized here for the first time and a new diagnostic ion and new fragmentation pattern were proposed for dihydrocapsaicin. The results indicated that UPLC/Q-TOF-MS was a powerful complementary tool for structural characterization by ESI-MS/MS.

Cirsium japonicum; Fragment; UPLC/Q-TOF-MS; Rapid Identification

2014-09-09

国家自然科学基金项目(1035102201000000)；教育部广东工业大学合作研究项目(2009B090300349，2011B090400379)

彭海博(1990-)，男，广东药学院硕士研究生，研究方向为中药质量控制。

冯毅凡，广东药学院教授，研究方向为药物分析。E-mail：tfengyf@163.com.

R284.1

A

1673-2197(2015)02-0016-03

10.11954/ytctyy.201502007