粒度对附子近红外定量模型准确性的影响

吴文辉，李文兵，陈咏梅，胡昌江*

(1.成都中医药大学，四川 成都 610075；2.四川新绿色药业科技发展股份有限公司，四川 成都 611930)



粒度对附子近红外定量模型准确性的影响

吴文辉1，李文兵2，陈咏梅2，胡昌江1*

(1.成都中医药大学，四川 成都 610075；2.四川新绿色药业科技发展股份有限公司，四川 成都 611930)

目的：观察样品粒度对附子近红外(NIR)定量模型准确性的影响。方法：采用近红外(NIR)光谱分析技术建立附子双酯型生物碱和单酯型生物碱含量测定模型，对同批次同产地不同粒度附子样品生物碱含量进行预测，并与化学测量值(HPLC)进行比较。结果：附子最粗粉与粗粉近红外(NIR)预测值与化学测量值(HPLC)误差较大，双酯型生物碱含量分别为15.251 4%和8.716 9%，单酯型生物碱含量分别为32.614 8%和17.946 7%，中粉～极细粉接近化学测量值(HPLC)且相差分别在5%和10%以内。结论：样品粒度对附子近红外(NIR)定量模型准确性存在一定影响，粒度越大，预测值与化学测量值(HPLC)误差越大，中粉～极细粉测定值较为稳定，可作为样品测定前处理标准。

附子；粒度；近红外；模型

附子为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx.子根的加工品，为回阳救逆之要药，具有补火助阳、散寒止痛的功效[1]。因其含有毒性较大的乌头碱(aconitine)、中乌头碱(mesaconitine)以及次乌头碱(hypaconitine)，故《中国药典》2010版附子项下对其双酯型生物碱和单酯型生物碱含量分别进行了上限与下限的规定，在确保其临床疗效的同时保证毒性较低[2]。因此，为避免临床中毒现象的发生，附子毒性成分的检测一直以来都备受关注。近年来，由于近红外(NIR)光谱分析技术的快速发展，为中药的检测提供了一种新型快速无污染的手段，特别是附子、川乌等有毒中药毒性成分的定性定量[3-4]。然而，目前对于影响近红外检测结果的诸多因素，如样本粒度等，却研究较少[5]。本研究以附子为研究对象，重点观察粒度对近红外定量模型准确度的影响，旨在为近红外(NIR)快速测定的准确性提供参考。

1 仪器与材料

美国Thermo antarisⅡ型傅立叶变换近红外光谱仪(美国Thermo Electron)；JY20002型电子天平(感量0.01g，上海方瑞仪器有限公司)；BJA-500型高速多功能粉碎机(浙江爱雪厨房设备有限公司)；DHG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验仪器设备有限公司)；1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)。

不同产地、批次附子由四川新绿色药业科技发展股份有限公司提供，经成都中医药大学药学院胡昌江教授鉴定为毛茛科植物乌头AconitumcarmichaeliiDebx.的子根加工品；新乌头碱(批号：MUST-13012207)、次乌头碱(批号：MUST-13011706)、乌头碱(批号：MUST-13012802)、苯甲酰新乌头原碱(批号：MUST-13032801)、苯甲酰乌头原碱(批号：MUST-13052306)、苯甲酰次乌头原碱(批号：MUST-13052301)。乙腈为美国Fisher色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品制备

取不同产地、批次附子样品，粉碎成中粉。每批次样品取3份，每份15g，共计90份样品，标记为1～90号。另取同一产地、同一批次样品，分别粉碎成最粗粉、粗粉、中粉、细粉、最细粉、极细粉，备用。

2.2 样品化学方法含量测定

参照《中国药典》2010年版附子项下“含量测定”方法进

行双酯型生物碱和单酯型生物碱含量测定[2]。

2.3 NIR光谱采集

将每份样品装入旋转石英杯中，摇匀，采用积分球漫反射测样，扫描波长范围为10 000～4 000cm-1，分辨率为8cm-1，扫描次数为64 次，温度为20℃，相对湿度为30%～50%。每个样品扫描3 次，计算平均光谱[6]。结果见图1。

图1 附子NIR光谱叠加

2.4 近红外定量测定模型建立

2.4.1 问题样品处理 问题样品是指NIR预测值与标准值间误差较大，在相关图上偏离对角线较远的样品。将出现问题的样品的Usage信息设为Ignore，结果见图2。

图2 附子样品马氏距离分布情况

2.4.2 主因子数选择 近红外定量模型建立过程中，主因子数是判断模型代表性的主要因素之一，因此在建立模型前，首先对最佳主因子数进行选择。由图3可知，双酯型生物碱最佳主因子数为10，单酯型生物碱主因子数为5。

2.4.3 光谱预处理方法选择 对光谱进行预处理可起到一定的放大和分离重叠信息的作用，可增加模型的预测准确性，见表1、表2。

图3 附子近红外定含量测定主因子数曲线

方案光谱预处理方法波长范围(cm⁃1)校正集RRMSECV验证集RRMSECV1Spectrum(原始光谱)+MSC(多元信号修正)5407．42～5295．574736．31～4366．054308．19～4111．490．81870．00850．6650．01082Firstderivstive(一阶导数光谱)+Norrisderivative+MSC(多元信号修正)4308．19～4111．494736．31～4366．055407．42～5295．570．97070．00360．86540．00723Firstderivstive(一阶导数光谱)+savitzky-golay+MSC(多元信号修正)4736．31～4643．757208．61～7096．767220．18～7212．470．67600．01090．51680．01314Secondderivstive(二阶导数光谱)+Norris-derivative+MSC(多元信号修正)4265．77～4134．635218．43～4701．605480．70～5249．290．66260．01100．50640．01355Secondderivstive(二阶导数光谱图)+savitzky-golay+MSC多元信号修正)4242．63～4223．344408．47～4300．489349．21～9175．640．36480．01370．06870．0162

表2 附子单酯型生物碱光谱预处理方法选择

从表1、表2可以看出，在附子双酯型生物碱模型中主因子数为10、附子单酯型生物碱主因子数为5的条件下：First derivstive(一阶导数光谱)+MSC(多元信号修正)+Norris derivative光谱预处理方法可得到较大的校正集相关系数R(0.970 7、0.937 0)和较低的标准偏差RMSECV (0.003 6、0.002 8)以及较大的验证集相关系数R(0.865 4、0.887 3)和较低的标准偏差RMSEPV (0.007 2、0.002 9)，故选择方案2为附子近红外测定模型光谱预处理方法。

2.4.4 定量模型建立 将1～70号样品光谱图作为校正集，71～90号作为验证集进行模型建立，运用TQ 8.0 定量分析软件PLS 建立定量分析模型，输入与每张图谱相对应的HPLC含量测定数值，计算得出模型。

2.5 结果

2.5.1 NIR定量分析模型 所建立的2个模型中，双酯型生物碱含量测定模型校正集标准偏差(RMSECV)为0.003 6，相关系数(R)为0.970 7，验证集标准偏差(RMSEPV)为0.007 2，相关系数(R)为0.8654；单酯型生物碱含量测定模型校正集标准偏差(RMSECV)为0.002 8，相关系数(R)为0.937 0，验证集标准偏差(RMSEPV)为0.002 9，相关系数(R)为0.887 3。结果见图4、图5。

图4 附子原药材双酯型生物碱含量检查模型谱

2.5.2 粒度对模型准确性的影响 NIR光谱中除了包含样品基质的化学组成信息外，还包含有样品的物理信息。如颗粒尺寸的不同会产生基线偏移；颗粒尺寸越粗糙，光线的穿透力越强，吸收越强，但颗粒的尺寸对模型测定准确的影响却没有明确定论。本实验按照《中国药典》2010年版凡例中对粉末的要求进行样品制备，观察粒度对附子生物碱近红外模型准确度的影响，结果见表3、表4。

图5 附子原药材单酯型生物碱含量测定模型谱

表3 双酯型生物碱含量测定结果 (%)

表4 单酯型生物碱含量测定结果 (%)

注：误差=(HPLC值-NIR值)/HPLC值×100。

由表3、表4可看出，样品的粒度越小，近红外测定值与化学测定方法(HPLC)值越接近，样品粒度越大则测定值误差越大。两个模型测定结果均显示：样品粒度在中粉～极细粉粒度范围内测定结果稳定，且接近化学测定(HPLC)值。

3 讨论

由图4、图5可看出，所建立的2个模型中，双酯型生物碱含量测定模型校正集标准偏差(RMSECV)为0.003 55，相关系数(R)为0.970 7，验证集标准偏差(RMSEPV)为0.007 16，相关系数(R)为0.865 4；单酯型生物碱含量测定模型校正集标准偏差(RMSECV)为0.002 80，相关系数(R)为0.937 0，验证集标准偏差(RMSEPV)为0.002 91，相关系数(R)为0.887 3。各参数均较优，模型可准确预测未知样品。由表3、表4可以看出，样品粒度越大，预测值与化学值偏差越大，样品粒度在中粉～极细粉粒度范围内测定结果稳定，且接近化学测定(HPLC)值。

附子单酯型生物碱预测模型中，主因子数为5，低于最佳主因子数10，说明模型未能代表附子所有产地和批次，模型覆盖面较窄，需在后期工作中补充样本量以增加模型数据库的全面性[7]。在表3与表4中，样品粒度越大，则误差越大，可能与样品粒度越大，漫反射光越少，多数光为透射和折射有关[8]。双酯型生物碱预测结果误差值显著小于单酯型生物碱预测误差值，可能与单酯型生物碱含量较少、数值较小有关。近红外光谱分析技术测定值本身与化学测定值存在一定误差，故数值越小，误差越大。

[1] 高学敏.中药学[M].北京:中国中医药出版社,2002.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2010:177.

[3] 高荣强,范世福.现代近红外光谱分析技术的原理及应用[J].分析仪器,2002(3):9-12.

[4] 全智慧.NIR分析技术在制川乌配方颗粒制备过程中的应用研究[D].广州:广州中医药大学, 2013.

[5] 杜敏.中药近红外光谱检测影响因素的研究[D].北京:北京中医药大学,2013.

[6] 柳俊.近红外光谱分析技术在白芍中药配方颗粒制备过程中的应用研究[D].广州:广州中医药大学,2011.

[7] 黄礼丽.近红外光谱分析技术的应用研究[J].科技创新与应用,2013(24):19.

[8] 严衍禄.近红外光谱分析基础与应用[M].北京:中国轻工业出版社,2005.

(责任编辑：尹晨茹)

Effect of particle size on the Accuracy of Near Infrared Quantitative Model ofAconitiLateralisPreparata

Wu Wenhui1,Li Wenbing2,Chen Yongmei2,Hu Changjiang1*

(1.Chengdu University of TCM,Chengdu 610075,China; 2.Neo-Green Pharmaceutical Co.Ltd.,Chengdu 611930,China)

Objective:To observe the effect of sample particle size on the accuracy of near infrared(NIR) quantitative model of Aconiti Lateralis Preparata. Methods:Determination of the content of technical analysis model of Aconiti Lateralis Preparata diester diterpenoid alkaloids and single ester type alkaloids by near infrared(NIR) spectroscopy with the same origin, the same batch of different particle size of Aconiti Lateralis Preparata root samples were predicted and chemical measurements (HPLC) were compared. Results:AconitiLateralisPreparata most coarse powder and coarse powder of near infrared(NIR) prediction value and chemical measurements (HPLC) error is large, double ester alkaloid non are 15.251 4% and 8.716 9%, single ester type alkaloids were 32.614 8% and 17.946 7%, fly to very fine powder close chemical measurements (HPLC) and the difference in 5% and 10% respectively in within the. Conclusion:The sample size has certain effects on the monkshood NIR quantitative model accuracy, the larger size, the predictive value and chemical measurements (HPLC) error is large, very fine powder in the powder to the determination of the value of relatively stable, can be used as determination standard sample pretreatment.

AconitiLateralisPreparata;Particle Size;Near Infrared;Model

2015-05-14

四川省科技创新苗子工程(No.2014-088)

吴文辉(1986-)，男，成都中医药大学博士研究生，研究方向为中药炮制与临床。

胡昌江(1952-)，男，成都中医药大学教授，博士生导师，研究方向为中药炮制与临床。

R284.1

A

1673-2197(2015)20-0007-04

10.11954/ytctyy.201520004