两种含苦参中成药中主要黄酮类成分定性鉴别方法研究

陈锡欣，黄 荣,刘 怡,陈 磊,2*

(1.广东药学院 中药学院，广东 广州 510006； 2.国家中医药管理局 中药数字化质量评价技术重点研究室，广东 广州 510006; 3.南方医科大学 中医药学院，广东 广州 510515)



两种含苦参中成药中主要黄酮类成分定性鉴别方法研究

陈锡欣1，黄 荣1,刘 怡3,陈 磊1,2*

(1.广东药学院 中药学院，广东 广州 510006； 2.国家中医药管理局 中药数字化质量评价技术重点研究室，广东 广州 510006; 3.南方医科大学 中医药学院，广东 广州 510515)

目的：首次探索建立含苦参中成药(当归苦参丸和四味土木香散)中黄酮类成分的定性鉴别方法。方法：采用薄层GF254硅胶板，鉴别三叶豆紫檀苷成分：以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(5∶7∶1)溶液为展开剂，喷以10%的硫酸乙醇溶液，挥干，再喷以10%的磷钼酸溶液，加热至斑点显色清晰，置日光下检视各样品与三叶豆紫檀苷标准品比较结果；鉴别苦参酮成分：以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(5∶5∶1)溶液为展开剂，挥干，置紫外光(365nm)下检视各样品与苦参酮标准品比较结果。结果：建立苦参中黄酮类成分三叶豆紫檀苷和苦参酮的薄层鉴别方法，在与对照品斑点相对应的位置上，供试品色谱显示相同颜色的斑点，且阴性无干扰。结论：该研究所建立的方法重复性高，操作简便，可用于薄层鉴别当归苦参丸和四味土木香散，可为其他含苦参中成药的定性鉴别方法提供参考。

四味土木香散；当归苦参丸；苦参；薄层鉴别；黄酮类成分

苦参为豆科槐属植物苦参(SophoraFlavescensAit.)的干燥根，始载于《神农本草经》。苦参性寒，味苦，具有清热燥湿、杀虫、利尿的功效[1]。

苦参主要含有生物碱和黄酮两大类化学成分，且两类成分含量基本相当[2]。近年来，国内外研究不断发现并确认，苦参生物碱和黄酮两类成分具有较多相同的药理活性，如抗炎、抗肿瘤等[3-6]。但目前《中国药典》及各级药品标准仍仅以缺乏专属性的生物碱[7]作为其药材、饮片及相关制剂的质量控制指标，不利于苦参药用资源的综合利用与开发，需进一步研究将苦参黄酮类成分纳入其质量控制体系。

经文献调研，结合前期工作，研究发现三叶豆紫檀苷和苦参酮为苦参中含量较高的两个黄酮类成分[8-9]，并已被证实有重要的药理活性[10-12]。当归苦参丸、四味土木香散均为以苦参为主药，且以原粉形式入药的中药制剂。本文以当归苦参丸、四味土木香散两个制剂为例，首次建立薄层色谱方法，鉴别其中三叶豆紫檀苷和苦参酮等主要苦参黄酮成分，为含苦参中药制剂中苦参黄酮类成分的定性鉴别提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

RE-3000型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，WD-9403C型紫外分析仪(北京市六一仪器厂)，SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑州长城工贸有限公司)，AY-120型精密电子天平(日本岛津)，PS-100超声清洗器。

1.2 试药

苦参(广州市药材公司中药饮片厂，YPA4G0002)；当归、山柰、土木香、珍珠杆，均购自河北安国中药材市场，经北京中医药大学王春国讲师鉴定均为正品。当归苦参丸(三批均购自北京同仁堂科技发展有限公司制药厂)。

四味土木香散(按2010版《中国药典》方法制备)、苦参酮对照品、三叶豆紫檀苷对照品均为自制[13]，经测试均符合定性鉴别要求。

1.3 方法

1.3.1 供试品溶液制备 鉴别三叶豆紫檀苷：取当归苦参丸6g，剪碎，置500mL圆底烧瓶中，每次加入5倍量80%的乙醇，加热回流提取2次，第1次1h，第2次30min，合并2次提取液，进行抽滤，将滤液浓缩至适量，作为当归苦参丸供试品；另取土木香10g、苦参10g、珍珠秆5g、山奈2.5g，按处方工艺制备四味土木香散，同“当归苦参丸供试品”法，制得四味土木香散供试品溶液。

鉴别苦参酮：取当归苦参丸6g，置500mL圆底烧瓶中，每次加入五倍量80%的乙醇，加热回流提取2次，第1次1h，第2次30min，合并2次提取液，进行抽滤，将滤液浓缩至适量，用同倍量的乙酸乙酯萃取2次，取乙酸乙酯层合并，浓缩至适量，作为当归苦参丸供试品溶液。另取土木香10g、苦参10g、珍珠秆5g、山奈2.5g，按处方工艺制备四味土木香散，同“当归苦参丸供试品”法，制得四味土木香散供试品溶液。

1.3.2 对照品、对照药材溶液制备 取苦参药材6g，剪碎，置500mL圆底烧瓶中，每次加入5倍量80%的乙醇，加热回流提取2次，其他按“1.3.1”项供试品溶液制备方法，制备苦参对照药材溶液；取苦参酮对照品，加甲醇制备浓度为1mg·mL-1的苦参酮对照品溶液；取三叶豆紫檀苷对照品加乙醇-丙酮(1∶1)溶液，超声至全部溶解，制备浓度为1mg·mL-1的三叶豆紫檀苷对照品溶液。

1.3.3 阴性对照溶液制备 取当归药材6g，按当归苦参丸制剂工艺，制备不含苦参药材的当归苦参丸阴性对照溶液；另取土木香10g、珍珠秆5g、山奈2.5g，按四味土木香散制剂工艺，制备不含苦参药材的四味土木香散阴性对照溶液。

2 结果

2.1 三叶豆紫檀苷的鉴别

2.1.1 当归苦参丸鉴别 按薄层色谱法，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液及阴性对照溶液，各1μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，于层析缸中上行展开，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(5∶7∶1)为展开剂展开，取出挥干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，挥干，再喷以10%的磷钼酸溶液，加热至斑点显色清晰，置日光下检视。见图1。

2.1.2 四味土木香散鉴别 按薄层色谱法，吸取上述供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液及阳性对照溶液，各1μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，于层析缸中上行展开，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(5∶7∶1)为展开剂展开，取出挥干，喷以10%的硫酸乙醇溶液，挥干，再喷以10%的磷钼酸溶液，加热至斑点显色清晰，置日光下检视。见图2。

图1 当归苦参丸中三叶豆紫檀苷薄层鉴别色谱

图2 四味土木香散中三叶豆紫檀苷薄层鉴别色谱

2.1.3 苦参酮鉴别 当归苦参丸：按薄层色谱法，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液、对照品溶液、阴性对照溶液以及阳性对照溶液各1μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，于层析缸中上行展开，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(5∶7∶1)为展开剂展开，取出挥干，置紫外光(365nm)下检视。见图3。

图3 当归苦参丸中苦参酮薄层鉴别色谱

四味土木香散鉴别：按薄层色谱法，吸取上述供试品溶液、对照品溶液、阴性对照溶液以及阳性对照溶液各1μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，于层析缸中上行展开，取出挥干，置紫外光(365nm)下检视。见图4。

图4 四味土木香散苦参酮薄层鉴别色谱

3 讨论

相较于生物碱，苦参黄酮类成分研究起步较晚。近年来，有多篇研究文献报道显示，苦参黄酮成分的抗菌、抗肿瘤作用强于其生物碱成分[14-16]；同时，发现苦参黄酮成分新的功能及适应证，可治疗阿尔茨海默病、抗糖尿病主要并发症(糖尿病肾病、糖尿病视网膜病)等[17-19]。山豆根、苦豆子等同属中药，具有与苦参较为相似的生物碱类成分，但存在明显不同的临床应用。但目前对于苦参的研究，可将两类成分割裂出来，在《中国药典》及各级药品标准仅对其生物碱类成分进行质量要求，亟需对苦参质量评价标准进行完善。

近年来，对国内苦参资源和市场跟踪调查发现，苦参的年用量为6 000～7 000吨，目前主要集中于生物碱部位及成分。苦参药材经水提取生物碱后，含有大量黄酮类成分的药渣被废弃，药效成分得不到合理利用，造成了药用资源的巨大浪费。深入研究苦参黄酮成分的药理作用，建立更加全面的质量控制标准，有利于解决中药苦参资源浪费的问题。

当归苦参丸和四味土木香散组方分别有2味和4味中药，其成分涵盖植物化学中多种成分，通过对苦参黄酮的薄层鉴别研究，确定了苦参酮和三叶豆紫檀苷的薄层鉴别方法，分离度好，阴性无干扰。实验过程中，分别采用6种不同的展开剂展开：二氯甲烷-甲醇(10∶1)、氯仿-甲醇-甲酸(5∶1∶0.5)、石油醚-乙酸乙酯-甲醇(5∶5∶1)、石油醚-乙酸乙酯-甲醇(5∶7∶1)、石油醚-乙酸乙酯-甲醇(5∶8∶1)、石油醚-乙酸乙酯-甲醇(5∶9∶1)。结果发现：三叶豆紫檀苷以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(5∶7∶1)展开，成点性较好，斑点清晰无干扰；苦参酮以石油醚-乙酸乙酯-甲醇(5∶5∶1)展开，系统较为理想。

4 结论

本实验中，三叶豆紫檀苷在未喷显色剂前，紫外分光光度法在365nm处为暗荧光斑点，喷以10%的硫酸乙醇加热显色后，日光检视为棕色斑点，再以紫外光365nm检视，出现明显的暗黄色斑点，最后喷以10%的磷钼酸溶液，日光下斑点更清晰。苦参酮在未喷显色剂前，紫外分光光度法在365nm处为蓝色荧光，喷以10%的硫酸乙醇加热显色后，日光下检视是暗黄色斑点，再用365nm检视，出现强暗斑点，一般在未染色前紫外检视可清晰辨认苦参酮斑点。

本试验对多批当归苦参丸和四味土木香散供试品薄层色谱鉴别环境进行考察，结果显示：在温度15～30℃、相对湿度20%～60%条件下，供试品色谱中主要斑点的分离度均较好；稳定性试验表明，样品在24h内薄层鉴别，供试品色谱中主要斑点的分离度较好；重复性试验表明，该方法重复性良好。

综上所述，本研究建立了苦参中黄酮类成分三叶豆紫檀苷和苦参酮的薄层鉴别方法，在与对照品斑点相对应的位置上，供试品色谱显示相同颜色的斑点，且阴性无干扰。该研究所建立的方法重复性高，操作简便，可用于薄层鉴别当归苦参丸和四味土木香散，可为其他含苦参中成药的定性鉴别提供参考。

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(责任编辑：李岚春)

Study on TLC Identification for Flavonoid Compounds in Two Traditional Chinese Medicine Patent Prescriptions Containing withSophoraFlavescens

Chen Xixin1, Huang Rong1, Liu Yi3, Chen Lei1,2*

(1.College of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China; 2.Key laboratory of Traditional Chinese Medicine Digital Quality Evaluation on The Technology, Chinese State Administration of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China; 3.College of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangdong 510515,China)

Objective:To establish thin layer distinction method for flavonoid compounds in Traditional Chinese Medicine (TCM) patent prescriptions containing withSophoraFlavescensflavonoid compounds.Methods:Using the silica GF254 thin layer plate. Trifolirhizin identification: used petroleum-ether-ethyl acetate-methanol (5∶7∶1) as the developing solvent, sprayed with 10% sulfuric acid in ethanol, evaporated to dryness, and then sprayed with 10% phosphomolybdic acid solution, heated the silica plate to spot the color clear, viewed the results of the sample comparing with trifolirhizin under the sunlight; Kurarinone identification: used petroleum-ether-ethyl acetate-methanol (5∶5∶1) as the developing solvent, evaporated to dryness, view the results of the sample comparing with Kurarinone standard under the UV (365nm) lamp.Results:Established a TLC identification method for Trifolirhizin and Kurarinone ofSophoraFlavescens, in the chromatogram, comparing with the reference spot corresponding position was the same color of the spots, and negative non-interference.Conclusion:The method was repeatable and simple, could be used for the TLC identification of Danggui Kushen pills and Siwei Tumuxiang powder, and also provided a reference for the other TCM patent prescriptions containing with Sophora flavescens flavonoid compounds.

Siwei Tumuxiang Powder;Danggui Kushen Pills;SophoraFlavescensAit.; TLC; Flavonoid Compounds

2015-08-21

国家自然科学基金项目(81303193、81403063)；南方医科大学青年科技人员培育项目(B1012115)

陈锡欣(1989-)，男，广东药学院硕士研究生，研究方向为中药分析化学与代谢。E-mail：harry173net@hotmail.com

陈磊(1981-)，男，博士，广东药学院副教授，研究方向为中药分析化学与代谢。E-mail：chenlei0080@163.com

R284

A

1673-2197(2015)20-0000-04

10.11954/ytctyy.201520015