姜黄素对脑缺血大鼠脑组织PI3K/AKT信号通路、Bcl-2、BAX的影响

仇志富，颜 勇，吴晓光*，丁 方，时召平

(1.承德医学院，河北 承德 067000；2.承德市中医院 药剂科，河北 承德 067000)



姜黄素对脑缺血大鼠脑组织PI3K/AKT信号通路、Bcl-2、BAX的影响

仇志富1，颜 勇1，吴晓光1*，丁 方1，时召平2

(1.承德医学院，河北 承德 067000；2.承德市中医院 药剂科，河北 承德 067000)

目的：探究姜黄素对脑缺血大鼠脑组织PI3K/Akt信号转导通路的影响及作用机制。方法：将72只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、姜黄素A组和姜黄素B组，每组18 只。其中模型组、姜黄素A、B组慢性脑缺血大鼠模型制备采用将大鼠两侧颈动脉结扎的方法，假手术组和模型组大鼠分别给予等剂量生理盐水。采用免疫组化法检测大鼠PI3K、AKT、Bcl-2、BAX蛋白表达情况，采用干湿重法检测脑组织水含量，采用甲酰胺法检测血脑屏障通透性。结果：与模型组比较，姜黄素组大鼠PI3K、AKT、Bcl-2蛋白含量均明显增高(P<0.05，P<0.01，P<0.05)，脑组织含水量、BAX表达及伊文思蓝含量显著降低(P<0.05，P<0.01，P<0.01)，差异均具有统计学意义。结论：姜黄素对缺血性脑损伤的保护机制可能是其穿透血脑屏障后激活了PI3K/AKT信号通路，介导Bcl-2蛋白表达增加以及BAX蛋白表达降低，进而调节二者平衡。

姜黄素；PI3K/AKT信号通路；Bcl-2；BAX

脑缺血再灌注损伤中最常出现的是细胞凋亡，细胞凋亡的机制复杂多样。在众多细胞凋亡机制涉及的信号转导通路中，PI3K/Akt信号转导通路最为重要，其发挥抑制细胞凋亡作用的机制可能是通过调控凋亡蛋白和凋亡基因实现的[1]。

神经营养因子可激活PI3K/Akt信号转导通路，但其作为大分子，很难通过血脑屏障，探究一种既能穿透血脑屏障又能将PI3K/Akt信号转导通路高效激活的药物迫在眉睫。姜黄素是近年来发现的一种脂溶性酚类色素，其从姜黄、莪术等姜科姜黄属植物的根茎中提取出来，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗细胞凋亡等药理作用，可防止神经元损伤，对神经性病变具有保护作用，可改善外周神经病、脑损伤等多种疾病症状[2]，但姜黄素对PI3K/Akt信号通路的影响未见报道。本研究通过观察姜黄素对脑缺血模型大鼠脑组织中的PI3K、AKT、Bcl-2、BAX等一系列蛋白的表达影响，观察其对大鼠脑组织含水量和血脑屏障通透性的影响，探究姜黄素脑保护作用及其可能的相关机制。

1 材料与动物

1.1 动物

SD大鼠(清洁级)，月龄11～12个月，数量72只，净重220～250g，大鼠称重编号后采用随机数字表法分组：假手术组、模型组、姜黄素A、B组，每组各18只。

1.2 试剂及仪器

采用DMSO将姜黄素纯品配制成终浓度为50mg/L的母液，过滤除菌后于-20℃避光存储，每次使用前将培养液稀释至所需浓度(终浓度<1/1 000)。PI3K、AKT兔抗大鼠多克隆免疫组化试剂盒；兔抗人Bcl-2、BAX多抗，SABC、DAB、细胞凋亡检测试剂盒；Multiskan MK3 酶标仪；MA1110型分析天平(精度0. 000 1g)。有机试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 造模与干预

采用35mg/kg水合氯醛麻醉大鼠后，参照NI J[3]方法造模，模型组、姜黄素A、B组脑缺血大鼠模型制备采用将两侧颈动脉结扎的方法，假手术组大鼠仅裸露颈总动脉、神经。于造模后第28天起，姜黄素A组(200mg/kg·d-1)和B组(300mg/kg·d-1)大鼠连续灌胃给予药物35天；假手术组及模型组大鼠灌胃给予等量生理盐水，频率同给药组。

2.2 PI3K、AKT蛋白表达检测

在最后给药的12h后，随机从每组中选出6只大鼠，采用乙醚麻醉后进行断头处理，摘取视交叉至漏斗部之间的脑组织，以10%CH3CHO浸泡，置于4℃冰箱固定48h，石蜡包埋，冠状切片厚度5μm，常规脱蜡、酒精浸水，以枸橼酸盐缓冲液微波法进行抗原修复，水洗后分别滴加兔抗大鼠PI3K(1∶150)、AKT (1∶100)多抗，于4℃下静置12h，孵育液30min，DAB显色之后苏木精复染，常规脱水、透明、封片。阳性细胞吸光度检测：MiVnt图形采集分析系统，取平均值，采用PBS作阴性对照。

2.3 凋亡调控蛋白检测

按照SABC步骤染片，将给药48h的脑组织切片脱蜡至水，严格按照试剂盒说明书操作进行，于高倍镜下观察胞浆着色，呈棕黄色的为阳性细胞。

2.4 脑组织含水量检测

各组随机选取6只大鼠断头、取脑，去除嗅球部分，称湿重后于90℃干燥箱干燥24h，再称重。按公式：含水量(%)=(湿重-干重) /湿重×100%，计算脑组织含水量。

2.5 血脑屏障通透性检测

采用2%伊文思蓝于每组遗留的6只大鼠尾部静脉注射，3h后以水合氯醛麻醉，采用200mL生理盐水于大鼠左心室注射冲洗血管内血液，取脑称量，脑组织放置于甲酰胺内，于60℃下水浴一整天，匀浆后离心(转速：1 000r/min、时间：6min)，于635nm波长处检测上清液的OD值，计算伊文思蓝含量。

2.6 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件系统，方差分析采用one-way ANOVA方法，先进行方差齐性检验，若齐则采用LSD检验，若不齐则采用Games-Howell检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠PI3K蛋白、AKT蛋白阳性表达时吸光度变化

PI3K蛋白、AKT蛋白若形成棕黄色物质沉积说明已发生阳性表达。结果表明，模型组大鼠PI3K表达量较假手术组明显升高(46.934±4.539)% ，AKT升高(55.29±2.06)%，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，姜黄素A、B组大鼠PI3K表达分别增加了(67.85±6.43)%、(72.36±7.12)%，AKT分别增加了(65.39±4.64)%、(72.38±5.16)%，差异均具有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠PI3K、AKT蛋白阳性表达吸光度改变情况 (±s,n=6)

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.01。

3.2 各组大鼠脑组织含水量改变

模型组大鼠脑组织水含量较假手术组增加了(19.93±4.69)%，差异具有统计学意义(P<0.05)；姜黄素A、B组大鼠脑组织水含量较模型组分别下降了(13.99±1.98)%和(12.99±1.97)%，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠脑组织含量水及伊文思蓝含量改变 (±s,n=6)

注：与较模型组比较，△P<0. 05；与假手术组比较，*P<0. 01。

3.3 血脑屏障通透性改变

模型组大鼠伊文思蓝含量较假手术组增加(596.39±129.79)% ，差异具有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，姜黄素A组、B组大鼠依文思蓝含量分别降低了(42.97±7.92)%和(39.85±7.93)%，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

3.4 各组大鼠Bcl-2、BAX蛋白表达变化

在梗死灶周围的皮质或纹状体内可见Bcl-2阳性细胞，假手术组大鼠仅可呈现少量Bcl-2、BAX反应。在缺血周边区，模型组及给药组大鼠Bcl-2蛋白表达量均较假手术组升高(P<0.01)，姜黄素给药组大鼠Bcl-2表达量明显高于模型组(P<0.01)，模型组及姜黄素给药组大鼠BAX蛋白表达量较假手术组明显增加(P<0.01)，姜黄素给药A、B组BAX表达量均高于缺血组(P<0.05)，差异均具有统计学意义。见表3。

表3 各组大鼠脑缺血再灌注后Bcl-2、BAX蛋白表达量比较 (±s,n=6)

注：与模型组比较，①P<0.05，②P<0.01。

3 讨论

脑缺血引起的神经元死亡主要以细胞凋亡为表现形式，细胞凋亡具有渐进性，及时有效抑制或减少缺血半暗带细胞凋亡是发挥脑保护作用的重要手段。

PI3K (磷脂酰肌醇3激酶)/AKT(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)信号转导通路作为细胞生存的信号通路之一，其在细胞增殖、分化、抑制神经细胞凋亡方面起到了重要作用[4]。脑缺血再灌注后，机体本身可以释放出一些能够激活酪氨酸激酶活性受体的物质，如神经细胞生长因子、整合素等，受体经过磷酸化后可特异性与PI3K的调节亚基结合，从而激活PI3K。兼备脂类激酶活性与蛋白激酶活性的PI3K激活后可使细胞膜上的肌醇发生磷酸化，生成第二信使PI3K，AKT作为PI3K下游的效应分子可与之结合，在既能够使AKT从细胞质向细胞膜转位的同时，又能够改变其构象，如此一来便可使AKT的Thr308位点以及Ser473位点发生磷酸化，使其由抑制状态变为激活状态。作为调节位点的Thr308和Ser473的磷酸化作用的发生是一前一后、互相独立的[5]，AKT活性的最终实现需要依赖Ser473 的磷酸化，AKT磷酸化激活后即成为p-AKT，其可衡量该通路的活化程度，通过参与多条信号转导途径来起到促进细胞增殖和阻止细胞凋亡发生的作用。AKT活化后控制凋亡的方式是通过直接将凋亡相关蛋白磷酸化或间接改变、编码凋亡相关蛋白的基因表达水平实现的，活化后的AKT通过磷酸化作用激活或抑制下游靶蛋白Bad、Caspase-3、NF-KB等，通过调控多种生长因子诱发细胞生长、促进细胞存活的生物学效应[6-8]。

AKT磷酸化后能促使Ser136位点的Bad发生磷酸化，形成一个可与伴侣蛋白14-3-3结合的位点进而形成复合物。当复合物形成时，Bcl-2或BCL-xl形成的异源二聚体中的Bad便会脱落下来，从而增加胞质中的Bcl-2或BCL-xl等的游离状态，以此发挥抗凋亡作用[9]。人们在对小鼠进行AKT基因剔除后发现，AKT的磷酸化水平有所降低，导致胞质中Bcl-2表达下调，BAX表达上调，使脑损害程度[10]进一步加重。AKT通过Bad磷酸化而将其激活，从而发挥抑制Bad加重脑损伤的作用；同时，又通过促进Bcl-2和BCL-xl解离而发挥抗凋亡作用。采用特异性PI3K抑制剂处理后，可在一定程度上降低AKT对Bad的磷酸化效果。同时，AKT也能将Ser184位点的BAX磷酸化，阻止BAX形成二聚体，抑制其促凋亡功能。

本实验结果表明，模型组大鼠PI3K及AKT磷酸化表达水平较假手术组显著增加，但细胞凋亡显著增多，血脑屏障通透性和含水量均显著升高，Bcl-2表达量降低，BAX表达量升高，脑保护功能降低。给予姜黄素后不但可减轻血脑屏障通透性和水肿程度，还可有效抑制细胞凋亡，增强PI3K及AKT蛋白活性，升高Bcl-2并降低BAX水平。因此，姜黄素发挥脑保护作用的主要机制可能是其在穿透血脑屏障后激活了PI3K/AKT信号转导通路，进一步介导Bcl-2、BAX发生相应变化，即增加Bcl-2蛋白表达，降低BAX蛋白表达，调节二者之间的比例，然而PI3K/AKT信号通路激活后可介导多种凋亡因子发生相应变化。本文仅研究了凋亡因子Bcl-2、BAX的变化，对于其他凋亡因子尚未进行研究，姜黄素激活PI3K/AKT信号通路后是否也能介导其他凋亡因子发生改变尚不明确，故其具体机制亟待进行更深入的研究。随着对神经细胞凋亡更加深入的研究以及与其相关信号转导通路机制的阐明，可为脑缺血的临床治疗提供更加明确的方向和靶点。

[1] 谢飞,魏珂,闵苏,等.神经生长因子对H9c2心肌细胞缺氧/复氧后凋亡的保护作用及其机制[J].中国药理学通报,2014(4):506-510.

[2] 李勇,王蓬文.姜黄素神经保护作用研究概况[J].中国中药杂志,2009,34(24):3173-3175.

[3] NI J,OHTA H,MATSUMOTOK. Progressive cognitive Impairment following chronic cerebral hypoperfusion induced by permanent occlusion of bilateral carotid arteries in rats [J]. Brain Res,1994,63(1):231-234.

[4] 张蔺珊,李娟娟,吴春云.脑缺血的损伤机制及相关信号通路的研究进展[J]. 神经解剖学杂志,2014,30(6):729-732.

[5] 郁迪,莫绪明.PI3K/Akt和MAPK信号通路在缺血性脑损伤中的保护作用[J]. 医学综述,2015(2):210-213.

[6] 黄雄峰,汪建民.葛根素的神经保护作用机制研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2015,21(4):224-230.

[7] 王小雄,司瑞,邵虹,等.红景天苷抑制缺血/再灌注诱导的心肌微血管内皮细胞凋亡[J].中国心血管杂志,2015,20(1):57-61.

[8] 秦宝宁,滕文静,刘瑞娟,等.大黄虫丸对慢性粒细胞白血病K562细胞增殖凋亡及PI3K/AKT信号传导通路的影响[J].时珍国医国药,2015,26(3):522-525.

[9] 马娜,郭瑞珍,阮媛,等. PI3K-AKT-Bcl-2抗凋亡途径与瘢痕癌癌细胞凋亡相关性探讨[J].中华肿瘤防治杂志,2014,21(8):599-604.

[10] 邹志坚,高增光,王晓敏,等.姜黄素对肺腺癌A549细胞PI3K/Akt/Bcl-2信号通路的作用[J].江西中医学院学报,2013,26(5):15-17.

(责任编辑：尹晨茹)

The Influence of Curcumin on PI3K/AKT Signal Pathway, the Bcl-2, BAX of Brain Tissue of Cerebral Ischemia Rats

Qiu Zhifu1,Yan Yong1,Wu Xiaoguang1，Ding Fang1，Shi Shaoping2

(1.Medical College of Chengde,Chengde 067000,China； 2.Department of Pharmacy，TCM Hospital of Chengde，Chengde 067000，China)

Objective:To explore the effects of curcumin on cerebral ischemia in rat brain PI3K/Akt signal transduction pathway and the possible mechanism.Methods:SD rats were randomly divided into four groups: sham operation group, model group, curcumin A group and curcumin B group, 18 rats in each group. The rats of model group, curcumin A, B group of chronic cerebral ischemia was prepared by the method of bilateral carotid artery ligation in rats, sham operation group and model group were given normal saline of the same. Immunohistochemistry was used to detect the expression of PI3K, AKT, Bcl-2, BAX protein, water content of brain tissue was detected by dry wet weight method, methanamide method to detect the permeability of blood brain barrier. Results:compared with model group, curcumin group, PI3K AKT and Bcl-2 protein were significantly increased (P<0.05,P<0.01,P<0.05), the water content of brain tissue, the expression of BAX and Evans blue content were significantly decreased (P<0.05,P<0.01,P<0.01),the significance are all obvious.Conclusion:Conclusion:the possible mechanism of the protective effect of curcumin on ischemic cerebral injury is the penetration of the blood-brain barrier after the activation of the PI3K/AKT signaling pathway, mediated by the increased expression of Bcl-2 protein, BAX protein expression decreased, the ratio between the two by adjusting to achieve.

Curcumin; PI3K/AKT Signaling Pathway; Bcl-2; BAX

2015-05-07

仇志富(1988-)，男，河北省承德医学院硕士研究生，研究方向为中药药理学。

吴晓光(1975-)，男，河北省承德医学院副教授，研究方向为中医药治疗脑病。

R285.5

A

1673-2197(2015)20-0011-03

10.11954/ytctyy.201520005