荧光光谱法研究磺脲类降糖药物与牛血清白蛋白的相互作用

刘家琴,王 坤,闻春雷,李美洁

糖尿病是一种多病因代谢性疾病,其特点是慢性高血糖,伴随因胰岛素分泌及作用缺陷所引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱,亦称“沉默的杀手”(Silent Killer).中国在年龄超过20岁的人群当中,糖尿病及糖尿病前期患病率分别达到9.7%和15.5%,已取代印度成为世界上糖尿病患者最多的国家[1].

糖尿病分为I型糖尿病、II型糖尿病.中国市场上临床口服降糖药主要有磺脲类、双胍类、α-葡萄糖苷酶抑制剂、胰岛素增敏剂和膳食调节剂五类[2].磺脲类药物有优降糖(格列本脲)、美吡哒(格列吡嗪)、达美康(格列齐特)、糖适平(格列喹酮)、亚莫力(格列美脲)等.研究药物小分子与蛋白质大分子间的作用机制,有助于了解药物在体内的运输和分布情况,阐明药物的作用机制、药代动力学及药物的毒副作用.而生物体内血浆中含量最丰富的蛋白质是血清白蛋白(Serum Albumin),对生命活动有着非常重要的作用,也是运输内源及外源性物质的重要载体[3].由于牛血清白蛋白(BSA)与人血清白蛋白(HAS)的结构相似,而BSA更价廉易得,故经常被人们作为研究药物与蛋白质间相互作用的理想蛋白质.荧光光谱法[4-14]是研究蛋白质和小分子配体相互作用的一种有效方法,本文运用荧光猝灭法研究了模拟生理条件下格列美脲、格列本脲与BSA间的相互作用,所得结果可为磺脲类降糖药物在药代动力学、生命科学、制药学、药效学以及临床医学方面提供参考依据和指导,并为新磺脲类药物的开发提供一定的参考.格列美脲(Glimepiride)、格列本脲(Glibenclamide)的结构式如下.

1 试验部分

1.1 仪器和试剂

RF-4500PC型荧光光度计(Hitachi,日本);微量可调移液器(Gilson,法国);酸度计(PHS-10A型,萧山市科学仪器厂);超级恒温水浴(SYC-15,南京桑立电子设备厂).

牛血清白蛋白(BSA,上海伯奥生物科技有限公司)储备液(1.0×10-4mol·L-1),用p H7.40 Tris-HCl缓冲溶液配制,4℃保存于冰箱;格列美脲/格列本脲(中国药品生物制品检定所)储备液(1.009×10-3mol·L-1/1.028×10-3mol·L-1),用甲醇配制;氯化钠(AR,1.0 mol·L-1)溶液;实验用水为二次蒸馏水;其他试剂均为分析纯.

1.2 实验方法

荧光光谱测定:依次移取1.0 mol L-1NaCl溶液1.0 m L、适量体积牛血清白蛋白溶液、格列美脲/格列本脲溶液于10 m L比色管中,以p H 7.40 Tris-HCl缓冲溶液定容.在激发波长为282 nm条件下扫描300～500 nm范围的荧光光谱(1 cm石英池、狭缝宽5 nm).

荧光滴定实验:依次移取1.0 mol·L-1的NaCl溶液0.3 m L、一定体积1.0×10-4mol·L-1BSA储备液、适量p H为7.40的Tris-HCl缓冲溶液于1 cm石英池中(三者体积总和为3.0 m L),逐次加入不同体积的格列美脲/格列本脲储备液(1.009×10-3mol·L-1/1.028×10-3mol·L-1),格列美脲/格列本脲最终浓度分别为6.727×10-6～3.363×10-5mol·L-1,6.853×10-6～3.427×10-5mol·L-1,反应5分钟后,在激发波长/发射波长(λex/λem)为282 nm/343 nm条件下测定不同温度下体系的荧光强度.

2 结果与讨论

2.1 荧光光谱

图1为模拟生理条件下BSA、不同浓度的格列美脲/格列本脲与BSA混合后的荧光光谱.

从图1可以看出:激发波长(λex)为282 nm时,BSA的最大发射波长(λem)为343 nm,表明BSA的荧光主要来自色氨酸残基.固定BSA的浓度,增大格列美脲/格列本脲的浓度,BSA的荧光强度随药物浓度的增大有规律地降低,表明格列美脲/格列本脲通过猝灭BSA内色氨酸残基的荧光,与BSA发生相互作用.

2.2 荧光猝灭机理、结合常数

按1.2中描述的荧光滴定实验方法测定了不同温度(298/297,302,310 K)下体系的荧光强度.根据修正的Sterm-Volmer方程:

式中F与F0分别代表有和无猝灭剂时荧光体的荧光强度,K为Stern-Volmer猝灭常数,f为荧光体的荧光被猝灭的分数,[Q]为猝灭剂(格列美脲/格列本脲)的浓度,以F0/(F0-F)对1/[Q]作图(如图2),由直线的斜率和截距可计算f和K的值(结果见表1).

图1 格列美脲/格列本脲-BSA体系的荧光光谱

表1结果显示:猝灭常数随温度升高而减小,表明格列美脲/格列本脲对BSA内在荧光的猝灭过程是静态猝灭,猝灭常数K即是该反应的结合常数.

表1 格列美脲/格列本脲与BSA相互作用的结合参数

2.3 格列美脲/格列本脲与BSA的作用力类型

药物小分子与生物大分子之间的结合主要借助于静电作用力、疏水作用力、氢键和范德华力,而衡量作用力类型的重要指标是反应的热力学参数.根据表1中不同温度下的结合常数,由van’t Hoff方程:

以ln KT对作图,由直线的斜率和截距计算焓变ΔH、熵变ΔS值,式中KT为不同温度的结合常数,R为气体常数.而后根据方程:

可得到自由能ΔG的值,结果列于表2.

表2 格列美脲/格列本脲与BSA相互作用的热力学参数

从热力学观点看,一定温度和压力下药物与蛋白质的结合反应能否自发进行,取决于体系的△G.根据Ross[15]的观点:△S＜0,△H＜0为氢键和范德华力.结合表2的结果,推测格列美脲/格列本脲与BSA的结合主要依赖于氢键和范德华力.

图2 格列美脲/格列本脲与BSA相互作用的Stern-Volmer图

3 结论

采用荧光光谱法研究了磺脲类降糖药物格列美脲/格列本脲与牛血清白蛋白之间的相互作用.实验结果表明格列美脲/格列本脲对BSA的荧光有猝灭作用,其猝灭机理为静态猝灭.根据不同温度(298/297,302,310 K)下二者各自与BSA作用的荧光强度,由修正的Stern-Volmer方程计算了与BSA反应的结合常数,其值分别为2.239×105,1.857×105,1.247×105L·mol-1和1.549×105,0.825 2×105,0.386 5×105L·mol-1;进而根据van’t Hoff方程计算了反应的热力学参数,并讨论了反应的主要作用力类型,其结果表明二者与BSA间的作用主要为氢键和范德华力.

参考文献:

[1]刘志帮,顾琴,顾顺,等.我国糖尿病的现状与展望[J].解放军药学学报,2004,20(2):130-133.

[2]杨穗彬,蔡德山,王萌.国内外抗糖尿病市场总览[J].中国医药技术经济与管理,2007,1(6):11-19.

[3]Rosenoer V M,Oratz M,Rothschild M A.Albumin Structure,Function and Uses[M].Oxford:Pergamon Press,1977:27.

[4]Ding F,Li N,Han B Y,et al.The binding of C.I.acid red 2 to human serum albumin:determinationof binding mechanism and binding site using fluorescence spectroscopy[J].Dyes Pigm,2009,83(2):249-257.

[5]Yan X N,Liu B S,Chong B H,et al.Interaction of cefpiramide sodium with bovine hemoglobin and effect of the coexistent metal ion on the proteindrug associ-ation[J].Journal of Luminescence,2013,142:155-162.

[6]Liu B S,Yan X N,Cao S N,et al..Interaction of salicylic acid with bovine hemoglobin and effect of the coexistent metal ion on the reaction[J].Spectroscopy Letters,2013,46(3):165-174.

[7]郭兴家,郭闯,姜玉春,等.光谱法研究氨基己酸与牛血清白蛋白的相互作用[J].应用化学,2010,27(10):1192-1198.

[8]谢显传,王晓蓉,张幼宽,等.荧光光谱法研究全氟辛酸与牛血清白蛋白的相互作用[J].中国环境科学,2010,30(11):1496-1500.

[9]刘家琴,田建袅,边清泉,等.马兜铃酸与牛血清白蛋白的相互作用研究[J].光谱学与光谱分析,2006,26(4):715-719.

[10]Wang Y Q,Zhang H M,Zhou Q H,et al.Studies on the interaction between imidacloprid and human serum albumin:Spectroscopic approach[J].Photochemistry and Photobiology B:Biology,2009,94:183-190.

[11]王芳,裴明砚,唐乾,等.药物与血清白蛋白相互作用中荧光光谱学的研究进展[J].大连大学学报,2009,30(3):39-44.

[12]Ghasem R B,Zari H,Pegah S,et al.Combined spectroscopic and molecular docking techniques to study interaction of Zn(II)DiAmsar with serum albumins[J].Journal of Luminescence,2014,156:55-62.

[13]Chen D D,Wu Q,Wang J,et al.Spectroscopic analyses and studies on respective interaction of cyanuric acid and uric acid with bovine serum albumin and melamine[J].Spectrochimica Acta Part A:Molecular and Biomolecular Spectroscopy,2015,135:511-520.

[14]Seyed Dorraji M.S,Panahi Azar V,Rasoulifard M H.Interaction between deferiprone and human serum albumin:Multi-spectroscopic,electrochemical and molecular docking methods[J].European Journal of Pharmaceutical Sciences,2014,64:9-17.

[15]Ross P D,Subraman A A.Thermodynamics of protein in association reaction:force contribution to stability[J].Biochemistry,1981,20:3096-3012.