TBX2 基因3′非翻译区位点rs59382073与汉族人群散发型先天性心脏病的易感性密切相关

王 凤 张 萍 段文元 俞立玮 赵健元 桂永浩



·论著·

TBX2 基因3′非翻译区位点rs59382073与汉族人群散发型先天性心脏病的易感性密切相关

王 凤1张 萍1段文元2俞立玮1赵健元3桂永浩1

目的 分析TBX2基因3′UTR变异位点与汉族人群散发型先天性心脏病(CHD)的遗传易感性是否关联，初步探讨其可能的发病机制。方法纳入2010年8月至2012年4月山东济南军区总医院心血管病研究所诊断的非综合征型汉族CHD为CHD组，以同期医院和社区体检的健康儿童为对照组。选择CHD组和对照组各24例行TBX2 3′UTR测序。根据测序结果在CHD组和对照组分别行SNaPshot基因分型和关联分析；通过细胞转染及荧光素酶检测对阳性位点进行功能分析。结果CHD组纳入768例，年龄(6.1±4.8)岁, 男383例(49.9%)；对照组纳入660例，年龄(6.5±3.2)岁, 男354例(53.6%)。①24例CHD和24例对照行TBX2 基因3′UTR 区测序发现3个已知的SNPs位点：rs59382073、rs1058004和rs729782，未检出新发SNPs位点。②样本采集中期CHD和对照组各288例样本的关联分析显示，rs59382073的基因型在CHD组和对照组的分布差异有统计学意义(P=0.012)；余2 个SNPs 在两组间差异无统计学意义(P>0.5)，后续样本未行该2个SNPs检测。③全样本关联分析显示，TBX2 3′UTR rs59382073位点与散发型CHD的患病风险密切相关，GT/TT基因型较GG基因型可导致CHD的患病风险增加2.13倍(OR=2.13, 95%CI：1.51～2.99,P=1.44×10-5)；进一步分层分析显示，与GG基因型相比，GT/TT基因型增加2.75倍圆椎动脉干畸形(OR = 2.75, 95%CI :1.57～4.81，P=3.99×10-4)、3.18倍法洛四联症(OR=3.18, 95%CI:1.53～6.61，P=1.90×10-3)和1.70倍室间隔缺损(OR=1.70, 95%CI:1.17～2.46，P=5.14×10-3)的患病风险。④细胞水平的功能研究提示，与G等位基因相比，转染T 等位基因可分别导致HEK 293 T及H9C2细胞的荧光素酶活性下降29.2%和33.6%。结论TBX2 3′UTR rs59382073 位点可显著增加汉族人群散发型CHD的患病风险；其不同等位基因的荧光素酶表达水平存在差异，为潜在的功能位点。

先天性心脏病；TBX2基因； 单核苷酸多态性； 3′非翻译区

TBX2基因是T-box转录因子基因家族的成员之一，表达于胚胎发生中的多个组织和器官。在鼠和鸡胚的心脏发育中，表达于流出道、内弯、房室管和流入道的心肌，与非腔室分化的心肌带相符[1～4]。作为潜在的转录抑制因子，Tbx2主要限制腔室特异性基因的表达，维持正常的心腔分化[1]。房室心肌Tbx2过表达导致心胶质和心内膜垫的异位，心肌保持原始状态，线性心管无法环化，腔室分化受阻[5]，而Tbx2纯合缺失的小鼠出现房室管和流出道的畸形[6]，提示其对于胚胎心脏的正常发育非常重要。

先天性心脏病(CHD)在活产婴儿中的发病率为6‰～10‰[7]，但对其发生机制的理解仍然很局限。研究显示，Tbx2 在心脏发育中的重要作用具有剂量敏感性[1]，其表达量的改变可能引发心脏畸形。然而，目前关于TBX2基因突变或表达异常引起CHD的研究较少，仅有的数据集中于17q23.1q23.2重复微缺失[8]、17q23.2重复(包含TBX2全基因)[9]以及启动子区突变[10]，而对于同样调控基因表达量的3′非翻译区(3′UTR)变异未见报道。为此，本研究拟通过较大样本量的CHD病例-对照研究，分析TBX2 3′UTR单核苷酸多态性(SNPs)分布与CHD发病风险的相关性，并尝试初探其可能的作用机制。

1 方法

1.1 伦理 本研究经复旦大学附属儿科医院伦理委员会批准，流行病学调查资料收集及血样采集均经研究对象知情同意。

1.2 CHD组纳入标准 ①济南军区总医院心血管病研究所诊断的汉族儿童CHD连续病例；②CHD经彩色多普勒超声心动图或心导管检查诊断，或外科手术证实。

1.3 CHD组排除标准 ①家族中有CHD患者；②合并心血管系统以外的畸形，如唐氏综合征、Holt-Oram综合征、Alagille综合征、DiGeorge综合征、William综合征和Noonan综合征等；③合并肿瘤等全身性疾病；④患儿家长拒绝参与研究。

1.4 对照组纳入和排除标准 ①济南军区总医院心血管病研究所就诊的健康儿童，济南军区总医院在济南市15所小学常规进行健康体检的儿童；②汉族；③性别和年龄与CHD组尽量匹配；④排除患遗传性疾病和CHD等出生缺陷者。

1.5 血标本的采集 CHD组为病例诊断时临床必须的采血；对照组为健康体检时临床检测的剩余血样。

1.6 位点初筛和分型预筛

1.6.1 位点预筛 为避免遗漏新发SNPs位点及确认本研究样本存在的位点，SNPs定义为最小等位基因频率(MAF)>1%的位点，即若需至少发现1例存在相应位点，则两组共需48例(1/96，>1%)，故选择CHD组和对照组各24例对TBX2 基因3′UTR 区行测序。

1.6.2 分型初筛 在样本采集的中期，对收集到的CHD组和对照组样本采用SNaPshot技术行基因分型预筛。对各基因型差异无统计学意义(P>0.5)的位点，后续收集的样本不再进行基因分析检测。为确认SNaPshot技术基因分型的准确性，选择20%的样本行测序验证，鉴定两种方法检测基因型的一致率。

1.7 基因分型

1.7.1 PCR产物纯化 取多重PCR扩增产物，加入TAKARA公司的ExoⅠ和SAP酶，按照说明提供的反应体系进行产物纯化。

1.7.2 延伸反应 依据测序结果获得相应位点信息，按表1设计延伸引物，取纯化产物，采用美国ABI公司的SNaPshot试剂盒行延伸反应。

1.7.3 基因分型 获得延伸产物后再次行产物纯化，取1 μL产物由ABI 3130分析仪毛细管电泳分析，应用Peak Scanner软件分析数据。

1.8 荧光素酶表达检测 为明确阳性位点是否为潜在的功能位点，采用细胞实验检测野生型和突变型重组载体转染对于外源荧光素酶表达量的影响，实验重复3次。

1.8.1 细胞培养 采用的大鼠心肌细胞(H9C2)购自中科院上海细胞库，HEK-293T 细胞为本实验室所有。采用DMEM 高糖完全培养基培养。所有培养基均添加10% 胎牛血清，含青霉素100 U·mL-1、链霉素50 μg·mL-1，置于37℃、5%CO2细胞培养箱。

表1 基因分型和质粒构建所用引物的DNA序列Tab 1 DNA sequence of all used primers

1.8.2 质粒构建 扩增目的片段，选择Promega公司的psiCHECKTM-2质粒多克隆位点的XhoⅠ和NotⅠ作为酶切插入位点进行野生型载体构建并测序验证。设计定点诱变引物(表1)，以构建好的野生型重组载体为模板，使用TOYOBO公司的KOD-Plus酶进行质粒诱变，构建突变型载体，并测序鉴定。

1.8.3 细胞转染 细胞按相应密度接种于24孔板，每孔(0.5～2)×105个细胞，铺板后18～24 h进行细胞转染。采用Life Technologies公司的脂质体Lipofectamine 2000和Gibco公司的Opti-MEM培养液、取荧光素酶重组报告载体100 ng进行细胞转染。转染后4～6 h换完全培养基继续培养。

1.8.4 荧光素酶检测 转染24 h后收集细胞。采用Promega 公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒，参照GloMax96 Microplate Luminometer 荧光检测仪使用说明，检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1 一般情况 2010年8月至2012年4月CHD组纳入768例，男383例(49.9%)，年龄(6.1±4.8)岁；对照组纳入660例，男354例(53.6%)，年龄(6.5±3.2)岁，两组性别构成和年龄差异均无统计学意义(P分别为0.09和0.06)。

CHD组参照Botto等[11]标准行CHD分型，包括间隔缺损520例(67.7%)、圆椎动脉干畸形97 例(12.6%)、右室流出道梗阻(RVOTO)26例(3.4%)、左室流出道梗阻(LVOTO)16例(2.1%)、肺静脉异位回流(APVR)13例(1.7%)、复杂CHD 13例(1.7%)、房室间隔缺损(AVSD)11例(1.4%)和其他72例(9.4%，如PDA等)。具体CHD表型中室间隔缺损(VSD)396例(51.6%)，房间隔缺损45例(5.9%)和法洛四联症45例(5.9%)。

2.2TBX2 基因3′UTR区SNPs的鉴定 CHD和对照组各24例行TBX2 基因3′UTR 区测序发现3个已知的SNPs位点：rs59382073(图1A)、rs1058004(图1B)和rs729782(图1C)，未检出新发SNPs位点。

2.3TBX2 基因3′UTR 区候选SNPs 的初筛 在样本采集的中期，CHD组和对照组各288 例采用SNaPshot 基因分型技术对上述3 个SNPs 行初步的关联分析。基因分型与测序鉴定基因型的一致率达100%。3个位点的分型成功率分别为98.6%(rs59382073)、96.5%(rs1058004)和97.0%(rs729782)。结果显示，rs59382073基因型在CHD组和对照组的分布差异有统计学意义[GG型：264/283(93.3%)vs248/285(87.0%); GT型：19/283(6.7%)vs37/285(13.0%)；P=0.012]，该位点位于3′UTR 终止密码子后第218 位。表2显示，余2 个SNPs 在两组间差异无统计学意义(P>0.5)，后续样本未行该2个SNPs检测。3个位点在对照组中的频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P均>0.05)。

图1TBX2 3′UTR鉴定出的3个SNPs测序图

Fig 1 Sequencing results of the three identified SNPs inTBX2 3′UTR

Notes A: rs59382073; B: rs1058004; C: rs729782

表2 TBX2 3′UTR鉴定的3个SNPs在CHD和对照组的基因型分布[n/N(%)]Tab 2 Genotype frequency of TBX2 3′UTR SNPs in CHD patients and controls[n/N(%)]

NotesPvalue of Hardy-Weinberg equilibrium in control group；In logistic regression analysis, dependent factors 1 and 0 denoted CHD group and control group, respectively

2.4 rs59382073位点与CHD的风险相关性分析 32例样本因未获得PCR产物而无法分型，故CHD组748/768例和对照组648/660例行基因分型。考虑到中期分期样本中未检出rs59382073 位点TT型，CHD风险关联分析时合并GT和TT型的数据。Logistic回归结果显示(表2)，与野生型GG 基因型相比，携带TBX2 3′UTR rs59382073位点的GT/TT基因型增加2.13倍CHD的患病风险(OR = 2.13, 95%CI ：1.51～2.99,P=1.44×10-5)，T等位基因较G等位基因增加2.24倍的CHD患病风险(OR=2.24, 95%CI：1.56～3.22，P=1.36×10-5)。

进一步按CHD 类型行分层分析(表3)，与GG基因型相比，携带GT/TT型者圆锥动脉干畸形的发病风险增加2.75倍(OR=2.75, 95%CI ：1.57～4.81，P=3.99×10-4)，VSD类型CHD患病风险增加1.70 倍(95%CI:1.17～2.46,P=5.14×10-3)，法洛四联症的发病风险增加3.18倍(95%CI：1.53～6.61，P=1.90×10-3)。

表3 rs59382073位点与各类CHD关联的分层分析Tab 3 Stratified analysis of rs59382073 with CHD classification

Notes LVOTO: left ventricular outfow tract obstruction; RVOTO: right ventricular outfow tract obstruction; APVR: anomalous pulmonary venous return. The GG and GT/TT in control group were 594/648 and 54/648, respectively

2.5 rs59382073位点荧光素酶的表达 荧光素酶的表达检测结果显示，在HEK 293T细胞系psiCHECK基线、psiCHECK-T、psiCHECK2-G载体的荧光素酶表达量分别为(1.82±0.05)、(2.38±0.11)和(3.36±0.22)；在H9C2细胞系分别为(12.8±1.80)、(16.9±2.0)和(25.5±4.13)；psiCHECK-T 载体的荧光素酶表达量均显著低于psiCHECK2-G 载体(P<0.05)。

3 讨论

本研究CHD组768例，对照组660例，是CHD遗传易感性研究中样本量较大的单一地区和单一民族研究。本研究通过汉族人群CHD病例对照设计，首次发现TBX2基因3′UTR 区SNPs位点rs59382073与CHD的发病风险显著相关，其中T等位基因为风险因子，增加了2.24倍的CHD患病风险(OR=2.24, 95% CI：1.56～3.22)。

TBX2基因定位于染色体17q23，包含7个外显子[12, 13]，其对于维持胚胎心脏的正常发生必不可少。Tbx2缺失的小鼠呈现流出道间隔缺损，且腔室特异基因的表达扩展至房室管区域[6]；Tbx2缺陷的斑马鱼则出现多种心脏表型，包括心室发育不良、心房扩张、房室管和瓣膜异常，以及心率缓慢、心律不齐、心脏停搏和血液反流等，提示Tbx2对腔室的分化和房室管的形成有重要的意义[14]。本研究显示，rs59382073 主要与圆锥动脉干畸形尤其是法洛四联症的发病风险显著相关，这与小鼠胚胎Tbx2缺失引起的流出道畸形相一致[6]。本研究还发现，GT/TT基因型较GG基因型者的VSD患病风险增加了1.70 倍 。 Pang等[10]在

VSD患儿中发现了TBX2基因启动子区DNA突变，提示TBX2非编码区遗传变异对于VSD的发生存在一定的作用。

Tbx2 在心脏发育中的重要作用呈现剂量依赖性[1]。Tbx2不仅可直接结合Anf、Cx40的启动子区并调控其表达[1, 6]，还可通过与Nkx2-5、Gata4、Msx1、Msx2结合并抑制相应下游基因的表达[2, 15]。此外，Tbx2可调控细胞周期相关基因p19(ARF)和p21(CIP1)的表达水平[16, 17]。同时，Tbx2受Tbx20、视磺酸及BNP2等因子的调控[18～21]。本研究为确定rs59382073位点是否具有潜在的功能，检测了G和T等位基因对于细胞转染后荧光素酶表达量的影响。结果显示，T等位基因在HEK 293T和H9C2两种细胞系中均可显著下调荧光素酶的活性, 表明TBX2 3′UTR rs59382073位点对于基因的表达量有着显著的影响。因此，推测携带T等位基因者可能由于TBX2的表达不足而增加CHD的发病风险。

本研究的不足之处：需要在不同地区、不同民族人群中进一步扩大样本量进行相关的病例对照研究；需要在CHD胚胎早期心脏组织中检测不同基因型样本TBX2基因mRNA和蛋白质的表达水平以进一步验证研究结果。

结论：本研究首次发现了在汉族人群TBX2 3′UTR位点rs59382073与CHD的发病关联，为完整阐述TBX2 对CHD 产生的遗传效应提供理论支持，对于临床检测亦具有一定的指导意义，在CHD 的基因诊断方面具有潜在的应用价值。

[1]Christoffels VM, Hoogaars WM, Tessari A, et al.T-box transcription factor Tbx2 represses differentiation and formation of the cardiac chambers.Dev Dyn, 2004,229(4):763-770

[2]Habets PE, Moorman AF, Clout DE, et al.Cooperative action of Tbx2 and Nkx2.5 inhibits ANF expression in the atrioventricular canal: implications for cardiac chamber formation.Genes Dev,2002,16(10):1234-1246

[3]Yamada M, Revelli JP, Eichele G, et al.Expression of chick Tbx-2, Tbx-3, and Tbx-5 genes during early heart development: evidence for BMP2 induction of Tbx2.Dev Biol, 2000,228(1):95-105

[4]Gibson-Brown JJ, I Agulnik S, Silver LM, et al.Expression of T-box genes Tbx2-Tbx5 during chick organogenesis.Mech Dev, 1998,74(1-2):165-169

[5]Shirai M, Imanaka-Yoshida K, Schneider MD, et al.T-box 2, a mediator of Bmp-Smad signaling, induced hyaluronan synthase 2 and Tgfbeta2 expression and endocardial cushion formation.Proc Natl Acad Sci U S A, 2009,106(44):18604-18609

[6]Harrelson Z, Kelly RG, Goldin SN, et al.Tbx2 is essential for patterning the atrioventricular canal and for morphogenesis of the outflow tract during heart development.Development, 2004,131(20):5041-5052

[7]Bruneau BG. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature, 2008, 451(7181): 943-948

[8]Ballif BC, Theisen A, Rosenfeld JA, et al.Identification of a recurrent microdeletion at 17q23.1q23.2 flanked by segmental duplications associated with heart defects and limb abnormalities.Am J Hum Genet, 2010,86(3):454-461

[9]Radio FC, Bernardini L, Loddo S, et al.TBX2 gene duplication associated with complex heart defect and skeletal malformations.Am J Med Genet A, 2010 ,152A(8):2061-2066

[10]Pang S, Liu Y, Zhao Z, et al.Novel and functional sequence variants within the TBX2 gene promoter in ventricular septal defects.Biochimie, 2013,95(9):1807-1809

[11]Botto LD, Lin AE, Riehle-Colarusso T, et al.Seeking causes: Classifying and evaluating congenital heart defects in etiologic studies.Birth Defects Res A Clin Mol Teratol, 2007,79(10):714-727

[12]Campbell C, Goodrich K, Casey G, et al.Cloning and mapping of a human gene (TBX2) sharing a highly conserved protein motif with the Drosophila omb gene.Genomics, 1995,28(2):255-260

[13]Campbell CE, Casey G, Goodrich K.Genomic structure of TBX2 indicates conservation with distantly related T-box genes.Mamm Genome, 1998,9(1):70-73

[14]Chong M(崇梅), Gui YH, Cheng L, et al. Establishment of model of congenital heart disease with Tbx2 gene knockdown: experiment with zebrafish. National Medical Journal of China(中华医学杂志), 2007, 87(14): 991-994

[15]Boogerd KJ, Wong LY, Christoffels VM, et al.Msx1 and Msx2 are functional interacting partners of T-box factors in the regulation of Connexin43.Cardiovasc Res, 2008,78(3):485-493

[16]Greulich F, Rudat C, Kispert A.Mechanisms of T-box gene function in the developing heart.Cardiovasc Res, 2011,91(2):212-222

[17]Boogerd CJ, Moorman AF, Barnett P.Protein interactions at the heart of cardiac chamber formation.Ann Anat, 2009,191(6):505-517

[18]Cai CL, Zhou W, Yang L,et al.T-box genes coordinate regional rates of proliferation and regional specification during cardiogenesis.Development, 2005,132(10):2475-2487

[19]Ma L, Lu MF, Schwartz RJ, et al.Bmp2 is essential for cardiac cushion epithelial-mesenchymal transition and myocardial patterning.Development, 2005,132(24):5601-5611

[20]Sakabe M, Kokubo H, Nakajima Y, et al.Ectopic retinoic acid signaling affects outflow tract cushion development through suppression of the myocardial Tbx2-Tgfβ2 pathway.Development, 2012,139(2):385-395

[21]Singh MK, Christoffels VM, Dias JM, et al.Tbx20 is essential for cardiac chamber differentiation and repression of Tbx2.Development, 2005,132(12):2697-2707

(本文编辑：丁俊杰)

A variant in TBX2 3′UTR, rs59382073, is significantly associated with susceptibility of sporadic congenital heart disease in Chinese Han population

WANGFeng1,ZHANGPing1,DUANWen-yuan2,YULi-wei1,ZHAOJian-yuan3,GUIYong-hao1

(1CadiovascularCenter,Children′sHospitalofFudanUniversity,Shanghai201102; 2InstituteofCardiovascularDiseaseGeneralHospitalofJinanMilitaryRegion,Jinan250022; 3SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200433,China)

GUI Yong-hao，E-mail:yhgui@shmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the association betweenTBX2 3′UTR variants and the susceptibility of sporadic congenital heart disease (CHD) in Chinese Han population and to reveal the possible mechanism.MethodsPatients with non-syndromic CHD diagnosed in Institute of Cardiovascular Disease, General Hospital of Ji′nan Military Region from August 2010 to April 2012 were included in CHD group, and healthy children receiving physical examination in this hospital during the same period as the control group. Twenty-four CHD cases and the same number of controls were selected to undergoTBX2 3′UTR DNA sequencing. According to our screening results, the identified variants were chosen for genotying by SNaPshot and association analysis in both groups. Then cell transfection and luciferase activity tests were conducted in functional analysis of the positive variant.ResultsA total of 768 cases were enrolled in CHD group, with mean age 6.1±4.8 years and 383 male subjects (49.9%). The control group included 660 subjects, with mean age 6.5±3.2 years and 354 male subjects (53.6%). ①Three known SNPs in 3′UTR were identified by DNA sequencing in our 24 CHDs and 24 controls: rs59382073, rs1058004 and rs729782. There was no novel variant. ②The initial association study in 288 cases and 288 controls indicated that genotypes of rs59382073 distributed significantly differently between groups (P=0.012), whereas no statistic disparity was observed for the rest two SNPs (P>0.05). Therefore, the two negative SNPs were not tested in the following subjects. ③Our all case-control analysis indicated thatTBX2 3′UTR rs59382073 variant was significantly associated with susceptibility of sporadic CHD. CT/TT genotype was significantly assocaited with higher risk of CHD (adjusted OR=2.13, 95%CI:1.51-2.99,P=1.44×10-5), and conotruncal defects (OR=2.75, 95%CI:1.57-4.81，P=3.99×10-4). And in stratified analysis, this association was further confirmed in tetralogy of Fallot (OR=3.18, 95%CI:1.53-6.61，P=1.90×10-3, compared with CC) and in ventricular septal defect(OR=1.70, 95%CI:1.17-2.46，P=5.14×10-3). ④Functional analysis of cells suggested that the luciferase activities of the T allele transfection were downregulated by 29.2% and 33.6% than the G allele in HEK 293T and H9C2 cells, respectively.ConclusionOverall, our data indicated thatTBX2 3′UTR rs59382073 polymorphism could significantly increase the susceptibility of sporadic CHD in Chinese Han population. The difference in luciferase activities between the two alleles demonstrates thatTBX2 3′UTR rs59382073 might be a functional polymorphism.

Congenital heart disease ;TBX2; Single nucleotide polymorphisms; 3′UTR

国家重大科学研究计划(973计划)：2013CB945401;国家自然科学基金：81170147,81300126

1 复旦大学附属儿科医院心血管中心 上海，201102; 2 济南军区总医院心血管病研究所 济南,250022；3 复旦大学生命科学院 上海，200433

桂永浩，E-mail:yhgui@shmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-5501.2015.03.002

2015-03-03

2015-05-17)