儿童急性B前体淋巴细胞白血病iTR35调节性T细胞亚群改变及意义初探

王力弘 王国兵 文飞球 刘四喜 王 缨 李长钢



·论著·

儿童急性B前体淋巴细胞白血病iTR35调节性T细胞亚群改变及意义初探

王力弘1,3王国兵2,3文飞球1刘四喜1王 缨1李长钢1

目的 探讨急性B前体淋巴细胞白血病(BCP-ALL)患儿iTR35调节性T细胞改变及其在BCP-ALL免疫发病机制中的作用。方法以2012年7月至2013年12月深圳市儿童医院血液肿瘤科诊断并住院治疗的BCP-ALL初诊患儿为BCP-ALL组，并分为高危、中危和标危；同期体检的健康儿童为对照组。分离外周血CD4+T细胞，采用流式细胞术检测外周血CD4+FOXP3-IL-10-TGF-β-IL-12p35+IL-27EBI3+(iTR35)、CD4+CD25highFOXP3+(Treg)细胞比例及IL-12p35、IL-27EBI3、pSTAT1、pSTAT4蛋白表达水平；实时荧光定量PCR检测CD4+T细胞IL-12Rβ2、gp130 mRNA表达；ELISA检测血浆IL-35、IL-10水平。 比较BCP-ALL组和对照组上述指标的差异。结果①BCP-ALL组 48例(男29例)，年龄2.3～11.0岁，平均5.2岁；高危11例，中危21例，标危16例。对照组32例(男21例)，年龄2.6～10.8岁，平均5.1岁。两组年龄和性别构成差异均无统计学意义。 ②BCP-ALL组外周血iTR35细胞比例显著高于对照组(P<0.001)，其胞内IL-12p35、IL-27EBI3表达水平亦显著高于对照组(P<0.001)；③BCP-ALL组Treg细胞比例及其胞内IL-12p35、IL-27EBI3表达水平较对照组明显增高(P<0.001)，血浆IL-35水平及CD4+T细胞IL-12Rβ2、gp130、pSTAT1、pSTAT4表达均上调(P<0.001)，且血浆IL-35水平与iTR35细胞比例及其IL-12p35、IL-27EBI3表达呈正相关(r>0.63，P<0.05)。④BCP-ALL组高、中危患儿血浆IL-35水平和iTR35细胞比例显著高于标危患儿(P分别为<0.001和0.002)，高危和中危患儿间差异无统计学意义(P>0.05)。结论iTR35细胞数量及功能异常可能是导致BCP-ALL患儿免疫功能低下的重要因素之一。

急性B前体淋巴细胞白血病； iTR35； IL-35； IL-12p35； IL-27EBI3

大量临床及基础研究提示，急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞恶性克隆与机体抗肿瘤免疫水平低下所导致的免疫逃逸密切相关，但导致ALL抗肿瘤免疫功能异常的分子机制仍不清楚[1]。iTR35是一类具有免疫调节作用的T细胞亚群，可抑制肿瘤特异性T细胞而参与调节抗肿瘤应答[2,3]。既往研究观察IL-35在胰腺癌、急性髓细胞样白血病和直肠癌患者血浆或肿瘤局部组织中表达异常，阻断IL-35可明显抑制肿瘤抗原特异性CD8+调节性T细胞[4～7]，提示主要以分泌IL-35而介导免疫抑制作用的iTR35细胞可能在肿瘤的免疫发病机制中发挥着重要作用。但目前尚未见有关于ALL与iTR35细胞分子机制的研究报道。本文观察急性B前体淋巴细胞白血病(BCP-ALL)患儿iTR35细胞亚群改变及其可能的分化调节机制，旨在进一步探讨BCP-ALL免疫发病机制。

1 方法

1.1 伦理 本研究经深圳市儿童医院(我院)伦理委员会审核同意，受试者家属对研究知情同意，自愿参加。

1.2 BCP-ALL组纳入和排除标准 ①2012年7月至2013年12月我院血液肿瘤科诊断并住院治疗的BCP-ALL初治连续病例；②根据细胞形态行FAB分型；③ 免疫学检查为CyIg阳性，其他B系标志如HLA-DR、CD19、CD22、CD10、CD20为阳性，SmIg阴性[8]；④排除合并其他肿瘤、自身免疫性疾病和遗传性疾病等患儿；⑤排除在外院未明确诊断前已使用药物治疗的患儿。

1.3 对照组纳入标准 同期我院体检的健康儿童，并除外先天性心脏病、遗传性疾病等，年龄与BCP-ALL组尽量匹配，获取其常规生化检查后的剩余血标本。

1.4 BCP-ALL 危险度分型 根据初诊年龄、外周血WBC计数、细胞遗传学改变、泼尼松敏感试验结果和诱导化疗第15、33天的骨髓缓解状况，将BCP-ALL患儿分为高危(HR)、中危(IR)和标危(SR)。

1.5 分离外周血CD4+T细胞 BCP-ALL组化疗前无菌采集EDTA抗凝静脉血3 mL。聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(P=1.077)密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)。按试剂盒(美国Invitrogen公司, 111.45D)说明，采用免疫磁珠分离外周血CD4+T细胞，锥虫蓝染色判定细胞活力>95%，流式细胞术检测细胞纯度>97%，备用。

1.6 实时荧光定量PCR检测CD4+T细胞IL-12Rβ2、gp130 mRNA ①总RNA提取与定量：取已分离外周血CD4+T细胞，按试剂盒说明书(美国Ambion公司，AM1912)步骤分离总RNA，紫外分光光度计测定RNA含量； ②逆转录PCR：按试剂盒(美国Fermentas公司，K1632#)说明，经逆转录合成cDNA。取 1 μL cDNA为模板，进行PCR扩增35～50个循环，参照Genebank中目的基因mRNA序列设计相关引物(表1,均由上海英骏生物技术有限公司合成)；③逆转录PCR产物鉴定：取IL-12Rβ2、gp130及β-actin扩增产物10 μL在2%琼脂糖凝胶中，90 V电泳30 min，回收纯化，并送上海英骏生物技术有限公司测序。测序结果与Genebank中目的基因mRNA序列比对，IL-12Rβ2、gp130及β-actin扩增产物与Genebank中目的基因mRNA序列完全一致。④实时荧光定量PCR: 采用SYBGreen试剂盒(大连宝生物，DRR820S)，使用罗氏LightCycle 480Ⅱ荧光定量PCR仪检测，应用LCS 1.5软件进行分析，结果以目的基因/β-actin的比值表示。具体操作参照试剂说明书。

1.7 流式细胞术检测(FCM) 采用全血直接计数法，以CD4-eFluro450设门，固定、破膜，经CD25-PE、FOXP3-APC抗体染色30min，检测CD4+CD25highFOXP3+(Treg)细胞比例；经pSTAT1-PE、pSTAT4-Alexa Flour647抗体染色后，检测CD4+T细胞pSTAT1、pSTAT4蛋白水平。另取1 mL外周血，经体外刺激(PMA：20 ng·mL-1, Ionomycin: 1 μg·mL-1)，2 μmol·L-1Monensin作为蛋白转运抑制剂，37℃、5%CO2下孵育6 h，以CD4-eFluro450、IL-10-PE、TGF-β-PerCP-Cy5.5和FOXP3-APC设门，固定、破膜，经IL-12p35-FITC、IL-27EBI3-PE-Cy7抗体染色30 min，检测CD4+FOXP3-IL-10-TGF-β-IL-12p35+IL-27EBI3+(iTR35)细胞比例及其胞内IL-35p35、IL-35EBI3蛋白表达水平；以CD4-eFluro450、CD25-PE和FOXP3-APC设门，经IL-12p35-FITC、IL-27EBI3-PE-Cy7抗体染色30 min后，检测Treg细胞内IL-35p35、IL-35EBI3蛋白表达水平。流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司，Canto Ⅱ)计数，全部数据经Diva Ver 6.1.3软件获取分析，IL-12p35、IL-27EBI3、pSTAT1及pSTAT4蛋白水平以平均荧光强度(MFI)表示。

表1 RT-PCR、实时荧光定量PCR引物Tab 1 Primers for RT-PCR and real-time PCR

1. 8 ELISA检测IL-10、IL-35水平 BCP-ALL组和对照组患儿外周血样本以肝素抗凝，500g离心10 min，分离上层血浆；采用双抗体夹心法检测血浆中IL-10(美国eBioscience公司，BMS215/2)、IL-35(美国MyBioSource公司，MBS720636)的水平，具体操作参照试剂说明书。

2 结果

2.1 一般情况 BCP-ALL组 48例，其中男29例，女19例，年龄2.3～11.0岁，平均5.2岁；HR 11例，IR 21例，SR 16例。对照组32例，其中男21例，女11例，年龄2.6～10.8，平均5.1岁。两组年龄和性别构成差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2 iTR35细胞亚群检测结果 表2和图1显示，经流式细胞术检测iTR35细胞改变，BCP-ALL组外周血iTR35细胞比例显著高于对照组(P<0.05)，其胞内IL-12p35、IL-27EBI3表达水平均显著高于对照组(P<0.05)。

Control(n=32)BCP-ALL(n=48)tiTR35/%0.06±0.010.89±0.3217.96 IL-12p35383±931227±29218.67 IL-27EBI3405±1131014±32711.86Treg/%4.0±2.19.7±3.58.95 IL-12p35108±31196±489.83 IL-27EBI330±8114±3018.72 pSTAT1/CD4+18.7±7.739.6±11.59.77 pSTAT4/CD4+23.1±9.251.9±15.710.36

Notes AllP<0.001

图1 BCP-ALL组和对照组iTR35细胞亚群流式检测结果 Fig 1The proportions of iTR35 and expressions of associated molecules detected by flow cytometry in BCP-ALL and control groups

Notes A:dot plots representing the proportions of iTR35 in patients with BCP-ALL and healthy controls; B: histogram representing expressions of IL-12p35 and IL-27EBI3 in iTR35 from patients with BCP-ALL and healthy controls; C: dot plots representing the proportions of Treg in patients with BCP-ALL and healthy controls; D: histogram representing expressions of IL-12p35 and IL-27EBI3 in Treg from patients with BCP-ALL and healthy controls; E:histogram representing expressions of pSTAT1 and pSTAT4 in CD4+T cells from patients with BCP-ALL and healthy controls

2.3 iTR35细胞分化调节信号相关分子检测结果 表2显示，BCP-ALL组Treg比例显著高于对照组，其胞内IL-12p35、IL-27EBI3表达水平显著上调(P<0.05)。BCP-ALL组IL-10和IL-35水平均显著高于对照组，IL-10：(78±21)vs(25±8)pg·mL-1；IL-35:(118±26)vs(62±18)pg·mL-1；P均<0.05。流式细胞术(表2)及实时荧光定量PCR结果显示(图2)，BCP-ALL组CD4+T细胞IL-12Rβ2、gp130 、pSTAT1、pSTAT4表达均显著上调[IL-12Rβ2：(0.076 2±0.022 8)vs(0.032 6±0.010 2)；gp130：(0.158±0.052)vs(0.065±0.019)；P<0.05]，且血浆IL-35水平与iTR35细胞比例及其IL-12p35、IL-27EBI3表达均呈正相关(r分别为0.63、0.77和0.72,P<0.05)。

图2 实时荧光定量PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

Fig 2 Agarose electrophoresis of RT-PCR products

2.4 iTR35细胞及其相关因子与BCP-ALL危险度的关系 BCP-ALL组HR、IR和SR患儿iTR35细胞比例(%)分别为(0.51±0.21)、(0.98±0.31)和(1.27±0.51)；血浆IL-35水平分别为(82±29)、(128±38)和(153±48)pg·mL-1。HR、IR患儿iTR35细胞比例和血浆IL-35水平均显著高于SR患儿(P分别为0.002和<0.001)，HR和IR患儿间差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

ALL是儿童最常见的恶性肿瘤，以原始和幼稚淋巴细胞恶性克隆为主，细胞大量增殖、广泛浸润，抑制正常造血，其病因及肿瘤免疫发病机制仍未完全清楚[1]。大量的研究表明肿瘤得以发生、发展的关键在于机体抗肿瘤免疫反应水平低下，使肿瘤细胞逃避免疫监视和清除机制[1, 9, 10]。iTR35是新近发现的一种调节性T细胞亚群，可通过分泌IL-35诱导Treg细胞增殖、抑制效应性T细胞活化，并将其转化为iTR35等多种机制发挥免疫抑制效应，在肿瘤的免疫发病机制中发挥重要作用[2～4, 11, 12]。既往的研究已证实多种实体瘤及血液恶性肿瘤IL-35表达异常，提示iTR35细胞可能与肿瘤的发生、发展存在密切的关系[4～7]。本研究观察到BCP-ALL患儿外周血iTR35细胞比例明显高于对照组，其胞内抑制性细胞因子IL-35表达亦显著上调，提示iTR35细胞亚群过度活化及功能异常可能是导致BCP-ALL肿瘤细胞免疫逃逸的重要因素之一。

诱导iTR35细胞的分子机制仍未完全阐明。与Treg不同的是，iTR35并不表达转录因子Foxp3，其分化及功能主要依赖于IL-35[2]。人IL-35由IL-12p35和IL-27EBI3两个亚基组成，主要来源于iTR35和Treg细胞[2, 3]。Treg细胞分泌的IL-35可与细胞表面IL-35R相结合，通过其IL-12Rβ2、gp130两亚基的胞内段促使STAT1、STAT4发生磷酸化，后者相互结合形成STAT1/STAT4异二聚体，启动IL-35基因表达及分泌，并在IL-10信号的协助下诱导初始T细胞分化为iTR35或将效应性T细胞转化为iTR35细胞。过表达的IL-35可诱导Treg细胞增殖及iTR35细胞的反复产生，从而形成正反馈循环效应介导免疫抑制功能[13, 14]。本文BCP-ALL组CD4+CD25highFOXP3+比例明显增加，其胞内IL-12p35、IL-27EBI3表达水平显著上调，提示Treg细胞数量增多及IL-35过表达可能是触发BCP-ALL患儿iTR35细胞异常活化的始动因素之一。活化的B细胞亦可产生和释放少量IL-35[15]，从而参与iTR35细胞的诱导分化。本文进一步分析IL-35信号相关分子的表达，发现BCP-ALL组血浆IL-35、IL-10水平及CD4+T细胞IL-12Rβ2、gp130、pSTAT1、pSTAT4表达均显著上调，且IL-35水平与iTR35细胞比例及其IL-12p35、IL-27EBI3表达呈正相关，提示IL-35信号过度活化可能是导致BCP-ALL患儿iTR35细胞数量及功能异常的关键因素。

鉴于IL-35介导的免疫抑制功能及其与肿瘤免疫发病机制中的作用，有研究已证实肿瘤细胞可通过高表达IL-35而抑制抗肿瘤免疫反应, 从而促肿瘤生长及新生血管的形成[16]。亦有多项临床及实验观察发现外周血IL-35水平与肿瘤恶化程度、临床分期及预后存在紧密的关联性[5, 7]。因此，本文分析iTR35细胞及其相关因子与BCP-ALL危险度的关系，发现HR和IR患儿iTR35细胞比例均明显高于SR患儿，但HR和IR间差异无统计学意义，提示iTR35细胞改变及其相关因子表达与BCP-ALL的恶性程度可能存在一定的关联性。

本文的不足之处和局限性：未能收集BCP-ALL患儿治疗后的长期随访资料及样本，因此对于iTR35细胞变化与BCP-ALL治疗的反应性及预后的关系尚缺乏有力的数据支持。

结论，BCP-ALL患儿iTR35细胞数量及功能异常可能与Treg细胞过度活化有关，且与BCP-ALL恶性程度可能存在一定的关联性，其中IL-35信号在iTR35细胞诱导分化及其免疫抑制功能介导机制中具有关键作用。

[1]Onciu M. Acute lymphoblastic leukemia. Hematol Oncol Clin North Am, 2009, 23(4): 655-674

[2]Collison LW, Chaturvedi V, Henderson AL, et al. IL-35-mediated induction of a potent regulatory T cell population. Nat Immunol, 2010, 11(12): 1093-1101

[3]Vignali DA, Kuchroo VK. IL-12 family cytokines: immunological playmakers. Nat Immunol, 2012, 13(8): 722-728

[4]Olson BM, Jankowska-Gan E, Becker JT, et al. Human prostate tumor antigen-specific CD8+ regulatory T cells are inhibited by CTLA-4 or IL-35 blockade. J Immunol, 2012, 189(12): 5590-5601

[5]Jin P, Ren H, Sun W, et al. Circulating IL-35 in pancreatic ductal adenocarcinoma patients. Hum Immunol, 2014, 75(1): 29-33

[6]Wu H, Li P, Shao N, et al. Aberrant expression of Treg-associated cytokine IL-35 along with IL-10 and TGF-beta in acute myeloid leukemia. Oncol Lett, 2012, 3(5): 1119-1123

[7]Zeng JC, Zhang Z, Li TY, et al. Assessing the role of IL-35 in colorectal cancer progression and prognosis. Int J Clin Exp Pathol, 2013, 6(9): 1806-1816

[8]Fang JP(方建培), Luo XQ, Tu LM, et al. A multiple-center clinical study on the therapy for childhood acute lymphoblastic leukemia by using GZ-2002 ALL protocol. J China Pediatr Blood Cancer(中国小儿血液与肿瘤杂志), 2011, 16(2): 60-65

[9]Kerkar SP, Restifo NP. Cellular constituents of immune escape within the tumor microenvironment. Cancer Res, 2012, 72(13): 3125-3130

[10]Malmberg KJ, Ljunggren HG. Escape from immune- and nonimmune-mediated tumor surveillance. Semin Cancer Biol, 2006, 16(1): 16-31

[11]Pan Y, Tao Q, Wang H, et al. Dendritic cells decreased the concomitant expanded Tregs and Tregs related IL-35 in cytokine-induced killer cells and increased their cytotoxicity against leukemia cells. PLoS One, 2014, 9(4): e93591

[12]Tao Q, Chen T, Tao L, et al. IL-15 improves the cytotoxicity of cytokine-induced killer cells against leukemia cells by upregulating CD3+CD56+ cells and downregulating regulatory T cells as well as IL-35. J Immunother, 2013, 36(9): 462-467

[13]Collison LW, Delgoffe GM, Guy CS, et al. The composition and signaling of the IL-35 receptor are unconventional. Nat Immunol, 2012, 13(3): 290-299

[14]Niedbala W, Wei XQ, Cai B, et al. IL-35 is a novel cytokine with therapeutic effects against collagen-induced arthritis through the expansion of regulatory T cells and suppression of Th17 cells. Eur J Immunol, 2007, 37(11): 3021-3029

[15]Shen P, Roch T, Lampropoulou V, et al. IL-35-producing B cells are critical regulators of immunity during autoimmune and infectious diseases. Nature, 2014, 507(7492): 366-370

[16]Wang Z, Liu JQ, Liu Z, et al. Tumor-derived IL-35 promotes tumor growth by enhancing myeloid cell accumulation and angiogenesis. J Immunol, 2013, 190(5): 2415-2423

(本文编辑：丁俊杰)

2015中国医师协会儿科医师分会风湿免疫年会通知

由中国医师协会主办，中国医师协会儿科医师分会和复旦大学附属儿科医院承办的2015中国医师协会儿科医师分会风湿免疫年会，将于2015年10月30日至11月1日在上海召开，同期举办由首都儿科研究所和复旦大学附属儿科医院承办的2015全国儿童风湿免疫病新概念研修班(国2015-06-01-217)。会议面向基层医师，将邀请国内知名儿科风湿免疫学专家就儿童关节炎、狼疮、预防接种不良反应、儿童过敏症、免疫缺陷和儿童反复感染等内容，进行大会报告、专题会议和专题研讨。参加人员将授予国家级继续医学教育项目学分。欢迎从事儿童风湿、免疫相关领域儿科医生包括计划免疫工作人员踊跃参加。

有意参与本次会议的医生请与复旦大学附属儿科医院临床免疫科(上海市闵行区万源路399号)孙金峤医生联系，E-mail: jinqiaosun@sina.com。

北京大学第一医院儿科招收神经电生理专业进修人员

有意进修者可在北京大学第一医院网站(www.bddyyy.com.cn)下载进修表，填写完毕后寄至北京市西城区西安门大街1号，北京大学第一医院儿科脑电图室，卢娇阳收；邮政编码100034；联系电话：010-83573082，010-83573037。本通知长期有效。

Changes and significances of inducible IL-35 producing regulatory T cells in childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia

WANGLi-hong1,3,WANGGuo-bing2,3,WENFei-qiu1,LIUSi-xi1,WANGYing1,LIChang-gang1

(1DepartmentofHematology, 2InstituteofPediatrics,ShenzhenChildren′sHospital,ZunyiMedicalCollege,Shenzhen518038,China; 3hasequalcontribution)

WEN Fei-qiu，E-mail:fwen62@126.com

ObjectiveTo investigate the changes and significances of inducible IL-35 producing regulatory T cells(iTR35) in childhood B-cell precursor acute lymphocytic leukemia (BCP-ALL).MethodsChildren with BCP-ALL were enrolled at the Department of Hematology Oncology, Shenzhen Children′s Hospital from July 2012 to December 2013, and sub-grouped as standard risk, intermediate risk or high risk. Age-matched healthy children who attending routine physical examination were recruited as controls during the same study period. CD4+T cells were isolated from peripheral blood mononuclear cells by microbeads. Flow cytometry was performed to evaluate the proportions of CD4+FOXP3-IL-10-TGF-β-IL-12p35+IL-27EBI3+iTR35 and CD4+CD25highFOXP3+Treg, and expression levels of associated molecules such as IL-12p35, IL-27EBI3, pSTAT1 and pSTAT4. Transcription levels of IL-12Rβ2 and gp130 in CD4+T cells were determined by quantitative real-time PCR. Plasma concentrations of IL-35 and IL-10 were measured by enzyme-linked immunosorbent assay.Results①Forty-eight children with BCP-ALL, including 11 children with HR, 21 children with IR and 16 children with SR, aged from 2.3 to 11 years with a mean of 5.2 years were recruited. The BCP-ALL group consisted of 29 males and 19 females, and 32 age-matched healthy children with 21 males were used as controls. No difference of age or sex was found between the two groups (P>0.05). ②The proportions of iTR35 in BCP-ALL group were much higher in the case group than those of control group(P<0.05), and the expressions of IL-12p35 and IL-27EBI3 increased remarkably (P<0.05). ③The proportions of Treg and the expression levels of IL-12p35 and IL-27EBI3 were elevated in BCP-ALL group(P<0.05). Meanwhile, plasma concentrations of IL-35 and IL-10 increased significantly in BCP-ALL group(P<0.05), Plasma concentrations of IL-35 positively correlated with the proportion of iTR35 and the expression levels of IL-12p35 and IL-27EBI3, respectively. Additionally, expression levels of IL-35-signaling downstream molecules (IL-12Rβ2, gp130, pSTAT1 and pSTAT4) in CD4+T cells were significantly up-regulated in BCP-ALL group(P<0.05). ④Plasma IL-35 concentrations and the proportions of iTR35 in BCP-ALL children with high risk or intermediate risk groups were found to be higher than those in BCP-ALL children of standard risk group (Pvalue was <0.001 and 0.002, respectively). No statistic significant differences were found in the two former group, although plasma IL-35 concentrations and the proportions of iTR35 in BCP-ALL children of high-risk group were higher than those in BCP-ALL children with intermediate risk group (P>0.05).ConclusionExcessive activation and dysfunction of iTR35 maybe one of the important factors contributing to immunological dysfunction in children with BCP-ALL.

B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia ; Inducible IL-35 producing regulatory T cells; IL-35; IL-12p35; IL-27EBI3

深圳市科技创新委员会技术创新计划技术开发项目:CXZZ20130320172336579;深圳市科技研发资金知识创新计划基础研究项目:JCYJ20140416141331552)

1 遵义医学院附属深圳市儿童医院血液肿瘤科 深圳，518038; 2 遵义医学院附属深圳市儿童医院儿科研究所 深圳,518038; 3 共同第一作者

文飞球，E-mail:fwen62@126.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2015.03.014

2014-12-22

2015-05-26)