实时荧光定量PCR检测黑参对S180荷瘤小鼠TNF-αmRNA表达的影响*

袁 媛，黄 赫，甘 雨，王 菲

(辽宁省中医药研究院，辽宁 沈阳 110034)



实时荧光定量PCR检测黑参对S180荷瘤小鼠TNF-αmRNA表达的影响*

袁 媛，黄 赫，甘 雨，王 菲

(辽宁省中医药研究院，辽宁 沈阳 110034)

目的 实时荧光定量PCR检测黑参对S180肿瘤模型小鼠TNF-αmRNA表达的影响，应用分子生物学手段分析黑参抑制肿瘤的机制。方法 采取腋下注射S180肿瘤细胞制得小鼠肿瘤模型，随机分成空白对照组、环磷酰胺组、消癌平组、红参高剂量组、红参中剂量组、红参低剂量组、黑参高剂量组、黑参中剂量组和黑参低剂量组。除空白对照组外，其他实验组均采取同时灌胃给药。测定小鼠给药前后体重、给药后瘤重，计算抑瘤率，利用IDTDNA设计引物，应用实时荧光定量PCR检测不同组TNF-α表达丰度。结果 与空白对照组相比，所有实验组肿瘤质量都有所减少。除消癌平和环磷酰胺外，使用高剂量黑参和低、中剂量红参对肿瘤重量的抑制较为显著(P<0.01)。实时荧光定量PCR显示，同对照组及其他实验组相比，高剂量黑参组和低剂量红参组TNF-α表达量上调(P<0.01，P<0.05)。结论 综上，使用高剂量黑参和低剂量红参能够提高小鼠TNF-α转录表达水平并减少肿瘤重量，其中高剂量黑参组效果更明显。

黑参；抗肿瘤；荧光实时定量；TNF-α

人参(PanaxginsengC.A.Meyer)为五加科植物人参的干燥根，是亚洲常见药材，具有很高的药用价值和历史文化价值，被誉为“草药之王”，在科学研究领域和国际市场一直占有极其重要的地位，已经被传统医学乃至全世界广泛应用。其性平，味甘、微苦，微温，用于大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津止渴、安神益智。现代临床医学和药理学研究表明，人参具有提高机体免疫力、抗疲劳、抗肿瘤、降血糖以及抗炎等多种活性，因此在医学及养生方面具有可观的价值。近年来，各种各样的人参炮制品作为功能食品用于饮食文化中，其中包括白参、红参、黑参等。黑参是利用传统的九蒸九曝炮制方法将人参反复蒸制烘干而得到的一种人参深加工品，是继红参后的又一新人参商品[1]。有文献报道，黑参比白参和红参有更强的抗肿瘤、抗炎、提高免疫力等生物活性。黑参具有很好的开发前景。

当人体受到某些外界不利因素影响，局部的细胞会发生失控性增殖而形成的新生物即肿瘤，常伴有肿块。肿瘤有良性和恶性之分，良性肿瘤通常可通过手术切除，而恶性肿瘤往往会导致癌症的发生。由于恶性肿瘤难以治疗和较高的死亡率，已成为21世纪人类的第一大杀手。正是因为如此，新的有效的抗肿瘤药物的研发势在必行。黑参的炮制方法各不相同，但大多是将鲜人参经过多次蒸晒而成的外观和化学成分发生改变的一类人参新炮制品。研究显示黑参除了具有提高免疫力、对抗炎症反应、防氧化、保护神经等功能，在抗肿瘤方面也发挥重要作用[2-5]。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)由单核细胞和巨噬细胞分泌，对肿瘤细胞有抑制和杀伤的功效，可被用来研究肿瘤的发生、发展[6]。本研究利用实时荧光定量PCR检测黑参对S180肿瘤模型小鼠TNF-α mRNA表达，从分子水平探讨黑参抗肿瘤机制。

1 实验材料

1.1 肿瘤细胞和实验动物 S180肿瘤细胞购自上海；SPF级实验小鼠90 只，(21±3)g，购自辽宁长生生物技术有限公司，许可证号：SCXK(辽)2010-0001。

1.2 实验药物 实验所用黑参和红参溶液为辽宁省中医药研究院科研制备。消癌平(南京圣和药业有限公司，批号：201304241)，刮去糖衣研成粉末待用；环磷酰胺(通化茂祥制药有限公司，批号：130201)，刮去糖衣研成粉末待用；红参购自辽宁省中医药研究院中药局；黑参按以往研究自制得到[2]。

1.3 实验仪器 罗氏MPLC 2.0全自动核酸分离纯化系统(德国罗氏公司)；罗氏LC480实时荧光定量PCR仪(德国罗氏公司)；罗氏组织匀浆仪(德国罗氏公司)。

1.4 实验试剂 罗氏RNA纯化试剂盒(组织用)货号03330591001；罗氏反转录第一链cDNA合成试剂盒货号04896866001；罗氏组织匀浆仪用锣盖管货号03358941001、罗氏SYBR GREEN染料货号04707516001；引物由本研究组设计，并由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

2 实验方法

2.1 构建S180荷瘤小鼠模型和给药 分组前称重，将90只小鼠按体重分为9组，即正常对照组、环磷酰胺组、消癌平组、红参低剂量组、红参中剂量组、红参高剂量组、黑参低剂量组、黑参中剂量组、黑参高剂量组。注射S180瘤株前外科手术器械高压灭菌。S180瘤株经生理盐水洗涤和活细胞计数后，在超净工作台中经小鼠腋下注射接种。正常对照组只构建肿瘤模型但不给药，消癌平组和环磷酰胺组给药量均为25 mg/kg(按成人每天服用量换算)，每天1次，连续10天。红参低、中和高剂量组小鼠给药量分别为13.6 g/kg生药量、27.2 g/kg生药量和40.8 g/kg生药量，每天1次，连续10天；黑参低、中和高剂量组小鼠给药量分别为13.6 g/kg生药量、27.2 g/kg生药量和40.8 g/kg生药量，每天1次，连续10天。

2.2 抑瘤率计算 小鼠给药第10天，禁食不禁水，第11天称量体重，用颈椎脱臼法处死小鼠，打开胸腔，完整剥离腋下肿瘤块、称取瘤块重量、拍照后将其冻存于-80℃冰箱待检。根据称得的重量，计算抑瘤率(inhibitory rate，IR)。计算公式为IR=(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重×100%。

2.4 提取瘤块总RNA及cDNA的获得 首先启动全自动核酸分离纯化系统，进行自动涂油脂(每次实验前)和漏液检测(每个月一次)。检查无故障后，选取小鼠新鲜瘤块组织，每组选3个，在电子天平上分别称取等质量(0.01 g)的瘤块并加到放有450μl组织裂解液的锣盖管中。使用罗氏组织匀浆仪6500 rpm，50s重复裂解2次。样品室温培育30 min。13000 rpm，2 min，吸取裂解匀浆350 μL加入到MPLC 2.0系统的样本槽中。将样本槽放到MPLC 2.0系统中，同时放置好洗脱槽、储存槽、加工槽、吸头站和反应吸头、废物袋等。依据“RNA Tissue Fresh-Frozen”程序选择样本量为200μl并按要求加注试剂桶，一切就绪后运行程序。

取5μl的各样本RNA，用罗氏LC480完成cDNA合成反应，按罗氏cDNA合成试剂盒说明依次添加Oligo(dT)18 1 μL，RNase free ddH2O 7 μL，混匀离心，65℃热变性10 min，然后加Protector RNase Inhibitor 0.5 μL，Reverse Transcriptase Buffer 4 μL，Deoxynucleotide Mix 2 μL，Reverse Transcriptase 0.5 μL，混匀离心，55℃ 30min，85℃ 5min，37℃+∞。

2.5 实时荧光定量PCR检测TNF-α基因的表达丰度 利用NCBI上ORF Finder找到小鼠TNF-α基因(GeneBank登录号：BC137720)的翻译区和非翻译区，并使用在线软件IDTDNA在其3’非翻译区设计基因特异性引物(GSP引物)，内参基因选择β-Actin。上游GSP引物F：5’-GGGTGTTCATCCATTCTCTACC-3’；下游GSP引物R：5’-GTCCCAGCATCTTGTGTTTC-3’。内参基因β-Actin-F：5’-GGCCGTGATCTCCTTCTG-3’；内参基因β-Actin-R：GGGACCTGACCGACTACCT。反应使用SYBR GREEN染料，在罗氏LC480实时荧光定量PCR仪上进行。每个样本三次实验学重复，反应体系包括罗氏SYBR GREEN Master Mix 10μl，上下游引物各1μl，cDNA模板2μl，RNase-free ddH2O 6μl。反应程序设置如下：95℃ 10min，然后95℃ 10s，60℃ 10s，72℃ 20s，50cycles。本研究使用相对定量方法，应用2-ΔΔCt分析数据。

2.6 统计学分析 利用SPSS 17.0统计软件处理数据，各组所得数据以平均值±标准差表示，不同组间的均值比较采用t检验，当P<0.05即两组的差异有统计学意义，当P<0.01则两组有显著性差异。

3 结果

3.1 各组小鼠S180实体瘤瘤重和抑瘤率 黑参高剂量组瘤重、环磷酰胺组瘤重、红参高剂量组瘤重与空白组相比有统计学意义(P<0.05)，抑瘤率方面也是这三组有统计学意义(P<0.05)，结果见表1。

表1 各组小鼠S180实体瘤瘤重和抑瘤率

注：与空白对照组相比，*P<0.05

3.2 各组实体瘤TNF-α基因的实时荧光定量PCR检测 如图1为所有实验组实体瘤TNF-α基因和内参β-Actin基因以Ct值为横坐标，以基因相对荧光强度为纵坐标的扩增曲线。该曲线显示目的基因和内参基因的指数增长期和平台期较为明显，在15-35个循环数范围内可检测到Ct值，扩增曲线正常，实验数据可靠，可用于相对定量分析。

图1 实验组TNF-α基因和内参β-Actin基因实时荧光定量PCR的扩增曲线，横坐标为Ct值，纵坐标为基因相对荧光强度

不同实验组TNF-α mRNA相对表达量的分析结果见图2和表2。消癌平组、红参低剂量组的TNF-α mRNA相对表达量与空白对照组相比具统计学意义(P<0.05)，黑参高剂量组具有显著性差异(P<0.05)。

图2 各实验组TNF-α mRNA相对表达量(RQ)的柱形图，纵坐标为相对表达量，空白对照组RQ设置为1

表2 各组小鼠TNF-α mRNA相对表达量(RQ)

分组相对表达量(RQ)分组相对表达量(RQ)空白对照组1 00±0 68红参高剂量组0 69±0 23消癌平组3 38±0 61∗黑参低剂量组0 38±0 58环磷酰胺组1 23±0 37黑参中剂量组0 82±0 48红参低剂量组3 67±0 44∗黑参高剂量组6 24±0 25∗∗红参中剂量组1 74±1 35

注：与空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01

4 讨论

人类社会迅猛发展随着而来的是自然环境污染、人口老龄化和不良生活习惯的产生，进而导致浊邪滋生和肿瘤化生。体内肿瘤坏死因子TNF-α有能够增强机体免疫功能、抗肿瘤等作用[7]，因此，未来我们可将TNF-α与黑参结合观察抗肿瘤疗效，为新药研发提供基础。

本实验使用S180荷瘤小鼠作为动物模型，TNF-α为检测基因，对黑参抗肿瘤分子机制进行研究。研究结果显示，使用黑参和红参对肿瘤重量都有抑制作用，以黑参高剂量组和红参低剂量组抑制作用较好，且高剂量黑参组抑瘤率高于已上市中药对照消癌平组，说明将黑参开发成抗肿瘤中药或保健品具有广阔前景。实时荧光定量PCR显示，黑参高剂量组、红参低剂量组和消癌平组同空白对照组相比TNF-α mRNA表达量上调，提示服用红参和黑参均能上调小鼠TNF-α mRNA的表达丰度且黑参高剂量组更明显，说明黑参可能通过上调TNF-α mRNA的表达丰度来发挥其抗肿瘤功效，而西药对照环磷酰胺组可能通过其他途径抑制肿瘤。

[1]袁媛，徐荣培.人参新炮制品—黑参的研究进展[J].中华中医药学刊，2013，31(11)：2379-2381.

[2]袁媛，于艳，徐荣培.HPLC法测定19个人参新炮制品—黑参样品中的人参皂苷含量[J].辽宁中医杂志，2013，40(10)：1993-1995.

[3]Seo YB.High value-added health food of black ginseng[M].Korea，2008：35-36.

[4]Kang KS，Kim HY，Pyo JS，et al.Increase in the free radical scavenging activity of ginseng by heat-processing[J].Biological and Pharmaceutical Bulletin，2006，29：750-754.

[5]Kim KT，Yoo KM，Lee JW，et al.Protective effect of steamed American ginseng on V79-4 cells induced by oxidative stress[J].Journal of Ethnopharmacology，2007b，111：443-450.

[6]丁凯宏.肿瘤坏死因子在肿瘤研究中的进展[J].吉林医学，2012，33(4)：823-824.

[7]崔力方，郭晓静，付丽.TNF-α与肿瘤发生发展关系的研究进展[J].中华乳腺病杂志(电子版)，2007，1(6)

Detection of the Effect ofBlackGinsengon TNF-α mRNA Presentation of S180 Tumor-bearing Mice by Real-Time Fluorescence Quantitative PCR

YUAN Yuan, HUANG He, GAN Yu, WANG Fei

(LiaoningInstituteofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110034,Liaoning)

Objective: To detect the effect ofBlackGinsengon TNF-α mRNA presentation of S180 tumor-bearing mice by real-time fluorescence quantitative PCR and analyze the tumor inhibition effect ofBlackGinsengby molecular biological method. Methods: Tumor-bearing mice models were made by armpit injection of S180tumor cells and were randomly divided into a control group, a cyclophosphamide group, aXiaoaipinggroup, high, medium and low dose groups ofRedGinsengand high, medium and low dose groups ofBlackGinseng. Except the control group, the other experimental groups were given intragatric administration. The mice weight in the pre-administration and the mice tumor weight in the post-administration were measured. Anti-tumor rate was calculated and IDTDNA primers were used. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect different TNF-α presentations. Results: Compared with the control group, the tumor mass in the experimental groups declined. Except theXiaoaipinggroup and the cyclophosphamide group, the high-doseBlackGinsenggroup and low and medium-doseRedGinsenggroups showed more obvious inhibition effect on tumor weight (P<0.01). Real-time PCR showed that when compared with the control group and other groups, the high-doseBlackGinsenggroup and the low doseRedGinsenggroup upregulated TNF-α presentation (P<0.01,P<0.05). Conclusion: The high-doseBlackGinsenggroup and the low-doseRedGinsenggroup can improve the TNF-α transcriptional presentation in mice and reduce tumor weight, among which the high-doseBlackGinsenggroup is more effective.

BlackGinseng, antitumor, real-time fluorescence quantitative PCR, TNF-α

辽宁省博士启动基金项目：黑参抗肿瘤药效物质基础研究(NO：20121135)< class="content">作者简介：袁媛(1980-)，女，汉，博士后，副研究员，研究方向：生药学，E-mail：yuanyuanvictory@163.com。

袁媛(1980-)，女，汉，博士后，副研究员，研究方向：生药学，E-mail：yuanyuanvictory@163.com。

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1007-2349(2015)09-0055-03

2015-06-22)