益肾养阴合剂对MRL/lpr小鼠狼疮性肾炎的保护作用及部分机制研究*

吴 洋，张巍琼，李东云，粟 荣，

(1.云南省中医医院，云南 昆明 650021；2.云南中医学院，云南 昆明 650500)



·实验研究·

益肾养阴合剂对MRL/lpr小鼠狼疮性肾炎的保护作用及部分机制研究*

吴 洋1，张巍琼2，李东云2，粟 荣1，

(1.云南省中医医院，云南 昆明 650021；2.云南中医学院，云南 昆明 650500)

目的 探讨益肾养阴合剂对肾功、肾脏病理变化及对P-STAT3表达的影响，揭示其发挥疗效的作用机制，为益肾养阴合剂治疗狼疮性肾炎(LN)提供理论依据。方法 两种种系相同不同品种的50只小鼠随机分5组：正常组C57BL/6J小鼠(0.9%生理盐水)；MRL/1pr小鼠根据尿蛋白含量随机分为4组：模型组、中药组、中药联合激素组、激素组，连续给药4周后观察P-STAT3、尿蛋白含量、血肌酐、尿素氮及肾脏病理变化。结果 在给药第一周，与模型组相比，尿蛋白含量在各治疗组之间无明显差异(P>0.05)。在第2、3、4周时，与模型组相比，各治疗组的尿蛋白、血肌酐、尿素氮含量均有显著下降(P<0.05)，中药联合激素组的尿蛋白含量最低(P<0.05)。给药处理后，p-stat3的表达均呈下降趋势，中药组、激素组的p-stat3表达相比模型组有所减少(P<0.05)；中药联合激素组的降低情况最为显著(P<0.05)。HE染色三个治疗组肾组织局部轻度系膜细胞增生，肾小球炎症细胞浸润减少。结论 1.益肾养阴合剂能改善MRL/lpr小鼠的肾功能及肾脏病理，且联合激素肾功能改善更明显。2.下调磷酸化的STAT3的表达可能是益肾养阴合剂治疗狼疮性肾炎的作用靶点之一。

益肾养阴合剂；狼疮性肾炎；MRL/lpr小鼠；P-STAT3；病理

系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)是一种累及多系统、多器官的具有多种自身抗体的免疫性疾病。SLE累及肾脏时称为狼疮性肾炎(Lupus Nephritis，LN)，是SLE最为常见和严重的表现，也是影响疾病预后和导致患者死亡的主要原因。SLE患者肾活检显示，肾脏受累者几乎为100%，其中有临床肾损害表现者，占45%～85%[1]。益肾养阴合剂是根据云南省中医医院风湿科常见病种优化诊疗方案制定的协定方药，在临床上运用多年，具有良好的疗效。本课题旨在观察益肾养阴合剂对MRL/lpr小鼠尿蛋白、血肌酐、尿素氮的影响及肾脏的病理变化，从组织、分子生物水平阐述益肾养阴合剂对肾脏的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 C57BL/6背景小鼠为正常组，MRL/lpr小鼠测量体重和尿蛋白以选取实验组小鼠：体重(29±3)g，尿蛋白(110±5)mg/mL。随机分为4组，分别为：模型组(给予0.9%生理盐水)；中药组(益肾养阴合剂)；中药联合激素组(益肾养阴合剂+醋酸泼尼松)；激素组(醋酸泼尼松)。

1.2 实验药物 益肾养阴合剂由云南省中医医院煎药房统一煎煮。醋酸泼尼松片(重庆科瑞制药(集团)有限公司，批号：H50020459)。

1.3 指标检测及方法 用BCA蛋白测定盒检测尿蛋白含量；比色法检测 血肌酐、尿素氮测定；Western blot检验P-STAT3测定；HE染色观察肾脏病理变化。

1.4 统计学方法 采用SPSS18.0软件进行统计学分析，组间比较采用t检验，或单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组尿蛋白比较 见表1。

表1 各时间点各组小鼠的尿蛋白检测结果

注：同一时间段不同组之间比较：△表示与正常组相比P<0.05；▽表示与模型组相比P<0.05；*表示与中药组相比P<0.05；○表示与中药联合激素组相比P<0.05；●表示与激素组相比P<0.05

由表1及图1可知：同一时间点，各组尿蛋白检测情况，在给药第一周后，与模型组相比，MRL/lpr小鼠的尿蛋白含量在各治疗组之间无明显差异(P>0.05)。在给药第2周时，与模型组相比，各治疗组的MRL/lpr小鼠尿蛋白含量均有显著下降(P<0.05)，差异有显著性意义。在给药第3周时，与模型组相比，MRL/lpr小鼠各治疗组的尿蛋白含量均有显著降低(P<0.05)，差异有显著性意义，但在中药组、中药联合激素组以及激素组这三组间的尿蛋白含量无统计学意义(P>0.05)。在给药第4周时，与模型组相比，各治疗组的尿蛋白含量均有显著降低(P<0.05)，其中中药联合激素组的尿蛋白含量降低最为显著(与中药组，p=0.000，P<0.05；与激素组，p=0.001，P<0.05)，而中药组与激素组的尿蛋白含量相比无统计学意义(p=0.265，P>0.05)。

图1 同时间点下不同组小鼠的尿蛋白检测情况

(NS.表示生理盐水；Trad.表示中药益肾养阴合剂；com.表示中药联合激素；PA.表示激素醋酸泼尼松；w.表示week，周)

2.2 各组肾功能指标及P-STAT3的结果 见表2。

表2 给药4周后，各组小鼠血清中血肌酐、尿素氮含量测定结果

注：△表示与正常组相比P<0.05；▽表示与模型组相比P<0.05；*表示与中药组相比P<0.05；○表示与中药联合激素组相比P<0.05；●表示与激素组相比P<0.05

图2 western blot法测定各组小鼠肾脏组织中p-STAT3表达情况结果图

从表2可知：中药联合激素组的血Scr值下降最明显(与中药组，P<0.05；与激素组，P<0.05)。而中药组和激素组的血肌酐含量无显著差异(p=0.791，P>0.05)。各治疗组的小鼠尿液中尿素氮含量均有显著下降(P<0.05)，其中中药联合激素组的尿素氮含量降低最为明显，另外，给药4周后，中药组的尿素氮含量比激素组更少(P<0.05)。

从表2和图2可得知：在正常组小鼠肾脏组织中p-stat3蛋白的表达非常弱，而MRL/lpr小鼠肾脏组织中p-stat3表达增强(P<0.05)；经给药处理后，p-stat3的表达均呈下降趋势，中药组的p-stat3表达相比模型组有所减少(P<0.05)；中药联合激素组的降低情况最为显著(与中药组，P<0.05；与激素组，P<0.05)，而激素组的p-stat3表达比中药组的高(p=0.038，P<0.05)。

2.3 肾脏病理切片HE染色结果 光镜下观察到正常组小鼠肾脏结构完整，无增生和炎症细胞浸润；MRL/lpr小鼠模型组肾组织中系膜细胞、内皮细胞呈轻中度增生，伴有炎症细胞浸润，部分肾小球体积增大，肾间质有单核细胞浸润，而三个给药组肾脏病变均较对照组有所减轻，局部轻度系膜细胞增生，肾小球炎症细胞浸润减少。(见图3)

图3 MRL/lpr小鼠肾组织病理切片HE染色×200

(注：A：正常组，B：模型组，C：中药组，D：中药联合激素组，E：激素组)

3 讨论

狼疮性肾炎当属“阴阳毒、红蝴蝶斑、日晒疮、肾痹、阳毒发斑”等范畴。孟如教授认为狼疮性肾炎的病因多与感受邪毒有关，热毒为关键，热毒伤阴而致阴虚火旺。在本病发展过程中多由肺、脾、肾三脏功能失调而内生瘀血、痰浊、湿热、水湿等病理产物。瘀血始终贯穿狼疮性肾炎的不同阶段，在缓解期，热毒已去，阴虚或气阴两虚为病机的主要方面[2]。益肾养阴合剂是根据本院风湿科常见病种优化诊疗方案制定的协定方药，该方由黄芪生脉六味二至丸加减化裁而成，具有益气固肾，养阴清热之功效。

系统性红斑狼疮是一种综合征，每个患者诱发疾病的因素和免疫系统缺陷都不尽相同。JAK-STAT信号通路参与细胞增殖、分化、凋亡、血管生成以及免疫调节等过程。近年研究发现[3]，JAK/STAT 通路与多种肾脏疾病中的足细胞、系膜细胞、肾小球血管内皮细胞、肾小管上皮细胞及间质炎症相关细胞的病理改变密切相关。JAK-STAT信号通路在细胞因子的传导过程中起重要的作用，调节机体的免疫功能及介导炎性反应等作用[4]。JAK / STAT 通路与炎症发生发展密切相关，不仅可以控制自身下游炎症相关基因的表达，还可以与其他多种炎症信号通路[核因子 κB(NF-κB)和转化生长因子 β(TGF-β)等通路]发生相互作用，在机体炎症反应过程中起着极为重要的调节作用。最近研究发现[5]，TGF-β1在狼疮性肾炎发病中起着免疫调节作用，P-STAT3表达减少，能抑制TGF-β1等细胞因子过度生成。P-STAT3是JAK-STAT信号通路的下游，STATs 家族能和DNA结合，且可和JAK等酪氨酸磷酸化信号通路偶联，把细胞外信号与细胞基因表达调控结合起来发挥转录调控作用。Harada等[6]发现SLE患者T细胞中磷酸化STAT3的表达比正常对照明显升高，减少STAT3能使SLET细胞向炎症组织迁移。本实验研究发现MRL/lpr小鼠肾脏组织中p-stat3表达增强，给药处理后，p-stat3的表达均呈下降趋势，中药组、激素组的p-stat3表达相比模型组有所减少(P<0.05)；中药联合激素组的降低情况最为显著(P<0.05)。三治疗组均能降低血肌酐、尿素氮、尿蛋白含量，中药联合激素组优于其他2组(P<0.05)，给药4周后，中药组的尿素氮含量比激素组更少(P<0.05)，说明在降低尿素氮方面，中药组的效果优于激素组。此外肾组织的HE染色发现，治疗组的肾小球损伤较模型组减轻。综上可知益肾养阴合剂能一定程度上起到保护肾脏的作用，中药联合激素对MRL/lpr小鼠肾脏保护作用更明显。

本课题研究，证实益肾养阴合剂能抑制P-STAT3增加，并改善肾功能，对狼疮性肾炎具有一定的治疗作用，体现了中医药保护肾脏的药理效应及其治疗狼疮性肾炎的较好疗效，充分发展中医药的优势，为治疗狼疮性肾炎提供新思路。

[1]王吉耀.内科学[M].第2版，北京：人民卫生出版社，2010：617.

[2]吉勤，魏敏.孟如教授治疗狼疮性肾炎的经验[J].云南中医中药杂志，2005，26(3)：66.

[3]Marrero MB，Banes-Berceli AK，Stern DM，et al.Role of the JAK /STAT signaling pathway in diabetic nephropathy.Am J Physiol Renal Physiol，2006，290(4)：F762-768.

[4]Kisseleva T，Bhattachacya S，Braunstein J，et a1.Signaling through the JAK/STAT pathway，recent advances and future challenges[J].Gene，2002，285(1-2)：1-24.

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[6]Harada T，Kyttaris V，Li Y，et al.Increased expression of STAT3 in SLE T cells Contributes to enhanced chemkine-med-iated cell migration[J].Autoimmunity，2007，40(1)：1-8.

Study on the Protective Effect and Mechanism ofYishenYangyinMixtureon Lupus Nephritis of MRL/lpr Mice

WU Yang1， ZHANG Wei-qiong2, LI Dong-yun2, SU Rong1

(1.YunnanProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Kunming650021,Yunnan；2.YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Kunming650500,Yunnan)

Objective: To study the effect ofYishenYangyinMixtureon renal function, renal pathological changes and P-STAT3 presentation and reveal its clinical mechanism in order to provide a theoretical basis for the treatment of lupus nephritis (LN). Methods: Two germ lines of different kinds of 50 mice were randomly divided into five groups. Normal C57BL/6J mice (0.9% saline) and MRL/1pr mice were randomly divided into four groups according to urinary protein content, a model group, a TCM group, a TCM combined hormone group and a hormone group and were administrated for 4 weeks to observe their P-STAT3, urine protein, serum creatinine, blood urea nitrogen and renal pathological changes. Results: In the 1st week administration, compared with the model group, the urine protein of each group was no significant difference (P>0.05). In the 2nd, 3rd and 4th week administration, compared with the model group, the urine protein, serum creatinine and urea nitrogen of each group significantly decreased (P<0.05), among which the urine protein of the TCM combined hormone group was lowest (P<0.05). After the administration, p-stat3 presentation showed a downward trend. The p-stat3 presentation of the TCM group and the hormone group decreased when compared with that of the model group (P<0.05). The p-stat3 of the TCM combined hormone group decreased most significantly (P< 0.05). HE staining of renal tissue of three treatment groups showed local mild mesangial cell proliferation and glomerular inflammatory cell infiltration reduction. Conclusions: A.YishenYangyinMixturecan improve the renal function and renal pathology of MRL/lpr mice, and improve more obviously when combined hormone. B. The reduced phosphorylation STAT3 may be one of the targets for the treatment of lupus nephritis.

YishenYangyinMixture, lupus nephritis, MRL/lpr mice, P-STAT3, pathology

国家中医药管理局十一五中医痹病学重点学科。< class="content">作者简介：吴洋(1962-)，女，主任医师，硕士研究生导师，研究方向：主要从事中西医结合风湿病的防治研究。
E-mail：451886900@qq.com

吴洋(1962-)，女，主任医师，硕士研究生导师，研究方向：主要从事中西医结合风湿病的防治研究。 E-mail：451886900@qq.com

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1007-2349(2015)09-0046-03

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