miR-423-5p 在冠心病不同亚型临床病人的诊断意义

谭艳武，罗伟陵，李 进，李建文，邓银辉，刘 骅，张成花

（湖南师范大学附属湘东医院，醴陵 412200）

冠状动脉粥样硬化形成粥样斑块引起血管管腔狭窄或阻塞，导致心肌缺血缺氧而坏死从而引起冠心病［1］。冠心病，为心肌梗死高发生率和致死率的主要原因。冠心病患者容易出现急、恶性心血管事件，有效的生物学标志物若能在早期对心血管事件作出明确的诊断从而可以提高患者生存率。目前，已证实miRNA 在血管生成和心血管疾病中均具有重要作用［2］。重要的是，研究报道 miRNAs 能稳定存在于血浆等组织液中，被称为循环 miRNAs，血浆 miRNAs 表达谱特征变化与疾病的病理学改变相关，这就提示循环 miRNAs 分子可作为一种疾病诊断、预后判断的新型标志物。miR-423-5p 已被证实能够参与高血压诱导的心衰和二型糖尿病抵抗，参与心肌梗死后左室重构，与心血管疾病的调节密切相关［3-7］，而 miR-423-5p 在冠心病不同亚型的作用尚未见文献报道。因此，本课题系统观察miR-423-5p 在AS 患者冠心病病人体内的表达变化，筛选出作为冠心病临床诊断的分子标志物，期望将miR-423-5p 研发成AS 新的有价值的核酸药物靶点和临床分子靶标，真正实现基础向临床转化，使病人获益。

1 资料与方法

1.1 临床资料及方法

1.1.1 病例入选筛选2013 年6 月～2014 年10 月间我院住院病人110 例，均为汉族且无血缘关系。按临床症状分组分成 4 组：急性心梗组（AMI），n=30，入选标准：入院前24 小时内胸痛持续时间>30 min, 硝酸制剂不能缓解，并有肌酸激酶同工酶（CK-MB）和肌钙蛋白（TnI）水平升高等心肌损伤证据，造影显示有血管病变；不稳定性心绞痛组（UAP），n=30，入选标准：心绞痛有加剧的趋势，或在静息状态或轻微活动时心绞痛复发，伴缺血性心电图改变，造影显示至少有1 支血管病变大于50%；稳定性心绞痛组（SAP），n=30，入选标准：出现胸前，下巴，肩部，背部，手臂等部位不适等临床表现，伴运动试验中下斜或水平的 ST 段下移>1mm，休息或硝酸制剂可缓解；冠脉阴性组（相对健康对照），n=20，入选标准：有胸痛症状的，但无心电图改变，造影显示无血管病变。排除标准：无心衰，肾衰，肝衰，血液系统疾病，恶性胖瘤，糖尿病等并发症。入院前2 周内，均未服用任何抗血小板、抗凝、溶栓药物及中药制剂，无出血性疾病，无肝病。全部研究对象在试验前签署知情同意书。

1.1.2 血浆样本采集所有入选病例，收集当天新鲜血液（EDTA 抗凝）5mL，分离血浆和PBMC （单个核细胞），-80°C 保存。择日将不同分组的血液样本，在室温下放置不低于30min，不超过2 h 的时间，3000r/min，4℃离心15min，收集上清血浆，贮存于-80℃冰箱保存下一步的RNA 抽提。

1.1.3 PBMC 的收集采用密度梯度离心法分离患者外周血单个核细胞，具体操作方法：取新鲜抗凝血5mL，与 PBS 溶液1∶1 混匀后，缓慢沿试管壁铺在1∶1 淋巴细胞分离液上，室温下1500r/min 离心20min，离心管中由上至下细胞分为四层。第一层，血浆或组织匀浆液层；第二层，环状乳白色淋巴细胞或单核细胞层；第三层，透明分离液层；第四层，红细胞层。用1mL Tip 收集第二层，再用PBS 重悬，以1000r/min 离心5～10min，重复二次，收集细胞，用于RNA 的提取。

1.1.4 microRNA 的抽提所有的样本均在冰上融化，取250μL 血浆中加入750μL TRizol（细胞直接加入1mL TRizol）混匀；加入10μL ath-MIR156amimics（20nM）混匀，作为外源性参照物，室温放置5min；加入200μL 氯仿（每1 毫升）蜗旋混匀15s，室温放置3～5min；之后12000r/min，4℃离心15min，转移上清到新的离心管（氯仿萃取可重复几次）；加500μL 异丙醇，混匀，-20℃过夜；然后13000r/min，4℃离心15min；80%的乙醇洗涤RNA 沉淀，7500r/min 离心5min；去上清，风干（不要风干过度）；最后加20～30μL-Nuclease-Free 双蒸水溶解RNA，溶液储存到-80℃备用。

1.1.5 采用特异引物对miRNA 进行逆转录反应取上述样本总 RNA 500ng 进行逆转录，反应液配制在冰上进行。反转录条件：37℃ 15min 进行逆转录；85℃5 s 使逆转录酶失活。逆转录完于 4℃冰箱保存。长期使用可保存于-20℃冰箱。

1.1.6 实时荧光定量 PCR（Real-Time PCR）反应以逆转录产物为模板进行 PCR 扩增，miR-423-5p 及外参引物由广州锐博公司设计、合成，所有操作均在冰上进行，设置 2 个复孔，各标本的相对表达量按公式 2-△△Ct计算，重复三次。

1.2 统计学方法数据分析使用SPSS 20.0 软件（SPSS公司，IL，美国）对数据进行分析。计量资料以均值±标准差（mean±SEM）表示。统计数据两组间均数比较采用独立样本t 检验，多组间均数比较采用ANOVA 方差分析，相关分析检验采用pearson 相关分析。以 P<0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 入选病例资料的基本临床特征相对健康对照组（CON），SAP，UAP 和 AMI 四组患者在年龄、性别、危险因素 （除了高脂血症外）等方面没有统计学差异（表1）。

特征 CON（20例） SAP（30例） UAP（30例） AMI（30例）

2.2 各组患者血浆及PBMCs 中 miR-423-5p 的表达

通常当气温降至-10℃时，24 h内开机 2～3 次，每次 1～1.5 h；气温降至-15℃时，24 h内开机 3～4次， 每次1.5～2小时；气温降至-23℃时，24 h内开机4～5次，每次2 h左右。随着气温下降，开机次数、开机时间也随之增加、延长。根据本地区气温变化情况，通过长期摸索，即可全面掌握在不同气温下开机次数、开机时间。

运用定量 PCR 检测血浆及PBMCs 中 miR-423-5p 的表达水平。结果显示在血浆中，miR-423-5p 的表达水平与外周血单个核细胞中表达基本一致，然而 SAP 与CON 组无明显差异。重要的是，在 PBMCs 中，SAP、UAP、AMI 组 miR-423-5p 的表达水平较 CON 组明显升高，且从 CON 至 AMI 过程中 miR-423-5p 的表达水平逐渐升高（图1）。

图1 四组患者血浆及PBMCs中 miR-423-5p 的表达水平

2.3 冠心病及非冠心病患者 PBMCs 及血浆中miR-423-5p 的表达水平根据冠状动脉造影结果显示，当冠状动脉狭窄程度≥50%时，确诊为冠心病（CAD），共57 例，而其他的为非冠心病（non-CAD），共 53 例。如图2 所示，冠心病患者血浆中miR-423-5p 的表达水平明显高于非冠心病患者，同时PBMCs 中 miR-423-5p 的表达水平同样明显高于非冠心病患者，与血浆的结果相吻合。

图2 冠心病及非冠心病患者血浆及外周血单核细胞中miR-423-5p表达变化

2.4 PBMCs 中miR-423-5p 的表达变化与病变冠脉血管数量的关系众所周知，病变血管数量与冠心病严重程度密切相关，我们采用qPCR 检测PBMCs 中miR-423-5p 的表达变化，分析其与病变冠脉数量之间是否存在相关性。我们发现有 2 支或大于等于 3 支病变血管的患者较无病变血管的患者，PBMCs 中 miR-423-5p 的表达水平明显升高，且随着病变血管数量增加，miR-423-5p 的表达水平逐渐升高。但 1 支病变血管的患者较无病变血管的患者，PBMCs 中 miR-423-5p的表达水平无明显统计学意义（图3）。

图3 PBMCs中miR-423-5p 的表达水平与病变冠脉数量的关系与0组比较，***P<0.001。0：表示无血管病变；1：表示1支血管病变；2：表示2支血管病变；3：表示大于或等于3支血管病变。

2.5 血浆及PBMCs 中 miR-243-5p 表达水平的关系为探讨血浆中miR-243-5p 的来源，我们采用Pearson 相关分析法分析血浆中miR-243-5p 的表达与PBMCs 中 miR-243-5p 表达变化的关系。结果显示血浆中miR-243-5p 的表达水平与 PBMCs 中 miR-243-5p 的表达水平呈正相关（r=0.81，P<0.001），这提示我们外周血中的 miR-243-5p 可能来源于外周血单个核细胞（图4）。

图4 血浆及PBMCs中 miR-243-5p 表达水平的相关性分析

3 讨论

冠状动脉性心脏病（CHD）简称冠心病，主要为冠状动脉粥样硬化所致，该疾病主要特点是由于脂质代谢异常，在动脉内膜下有类似于粥样的脂类物质沉着而形成的斑块导致［8］，斑块的日益堆积造成动脉管腔狭窄，血管阻塞，致使心肌缺血缺氧，发生心绞痛。冠心病是当今世界威胁人类健康的重要疾病之一。随着生活水平的提高，饮食习惯和生活方式的改变，冠心病的发病率和病死率也呈逐年上升的趋势［9］。冠心病患者容易出现急、恶性心血管事件，而发生心绞痛或者急性心肌梗死（AMI），甚至猝死［10］。因此，如何早期识别冠心病的疾病进展，以进一步指导临床医生及早做出应对措施，对于降低冠心病潜在的病死率具有重要的临床价值。

miRNAs 在机体生理和病理的发展过程中发挥着巨大的作用，越来越多的研究者利用 miRNA 芯片等高通量的检测手段［11,12］，分析 miRNAs 在正常生理过程和疾病过程中的作用。由于miRNAs 能稳定存在于血浆等组织液中，又与疾病表达谱的特征变化及疾病的病理学改变相关，提示我们血浆相关miRNA 的研究可能为疾病诊断找到新的生物标记物和新的治疗靶点。因此，众多研究者一直致力于循环 miRNAs 在疾病的诊断和治疗方面的研究［13］。

为了阐明 miR-423-5p 是否参与冠心病发病过程，首先我们检测 CON、SAP、UAP、AMI 患者血浆及外周血单个核细胞中miR-423-5p 的表达。结果显示，miR-423-5p 即能在血浆及外周血单个核细胞中检测出来，且冠心病患者血浆及外周血单个核细胞中miR-423-5p 的表达较非冠心病患者明显升高。此外，我们还发现在血浆及外周血单个核细胞中，SAP、UAP、AMI 组中miR-423-5p 的表达水平较 CON 组明显升高，且随着疾病的进展，miR-423-5p 的表达水平逐渐升高，然而SAP 与CON 组无明显差异。有趣的是，血浆中 miR-423-5p 的表达水平与外周血单核细胞中 miR-423-5p的表达水平呈正相关。最后，我们也发现PBMCs 中miR-423-5p 的表达变化与病变冠脉血管数量的存在密切相关性。

我们实验发现血浆中miR-423-5p 的表达水平与外周血单核细胞中 miR-423-5p 的表达水平呈正相关。这就提示我们，血浆中miR-423-5p 可能来源于外周血单核细胞中 miR-423-5p 的分泌。关于循环 miRNAs 是怎样释放入血的机制尚不明确。越来越多的证据表明，miRNAs 能以稳定的形式在血浆中［16］，且能经受反复冻融，说明循环 miRNAs 是能抵抗 RNA 酶依赖的降解方式。有研究表明受损心肌细胞中miR-423-5p 表达上调［14］推测血浆miR-423-5p 中可能来自心肌细胞的释放。相关研究显示 miRNAs 可以微泡的形式分泌［17］，同时miRNAs 也能在内皮细胞衍生的凋亡小体中检测到。而这些被纳入微泡或凋亡小体中的 miRNAs 可通过结合AGO 或脂蛋白被传递至受体细胞［18-20］，进而发挥其生物学作用。我们的研究证实了以往报道，即循环miRNAs 可以被分离且在人外周血中能检测到［21］，也阐明了血浆中 miR-423-5p 的表达模式与外周血单个核细胞中 miR-423-5p 的表达相一致，结果表明血浆中的miR-423-5p 可能来源于外周单个核细胞的分泌。本研究发现在PBMCs 中miR-423-5p 的表达变化与病变冠脉血管数量的存在密切相关性，提示我们miR-423-5p与冠心病发生发展的过程密切相关，且参与冠脉病变范围的调节。

综上所述，循环 miR-423-5p 可望作为心血管疾病的一种新的标记物或治疗靶点。然而循环 miR-423-5p 能否取代传统的心血管病标记物，如肌钙蛋白、肌酸激酶等，尚需进一步研究证实。首先， miR-423-5p 应该被证实与心肌损伤有关，且具有高敏感性及特异性。第二，作为疾病标记物必须在心肌损伤前就能检测到，因此，我们还需进一步证实循环miR-423-5p 与冠心病相对应的动态变化。最后，血浆中分离出 miR-423-5p并进行定量 PCR 检测需要较长时间且费用昂贵，因此探讨一种有效且快速的检测方法势在必行。尽管存在上述不足，但是随着检测技术的不断完善及人们对其认识的逐步深入，miR-423-5p 有可能补充肌钙蛋白、肌酸激酶等特异性生物标记物的不足，成为更具优势的标记物，重要的是，miR-423-5p 也可能用作冠心病防治的药物干预靶点。

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