响应面法优化草鱼鱼鳞柠檬酸-苹果酸钙提取工艺

谭文溢，聂乾忠，管 维

（1.湖南农业大学，湖南 长沙 410128；2.湖南省南岳衡山国家级自然保护区管理局，湖南 衡阳 421900）

0 引言

中国是渔业大国，淡水鱼的产量丰富，其中草鱼产量占世界总产量的90%以上.但我国在水产开发和加工方面仍与世界水平有较大差距[1].鱼鳞是鱼加工过程中产生的主要下脚料之一，我国每年因加工所产生的鱼鳞高达65 余万t，往往被当作废弃物处理掉，造成了极大的资源浪费[2].

钙是人体中不可缺少的矿物质元素，钙的缺乏容易引起骨质疏松症、佝偻病、骨质软化症等疾病[3].柠檬酸-苹果酸钙又名果酸钙，是柠檬酸和苹果酸与钙离子复合构成的钙盐[4].柠檬酸-苹果酸钙较其他钙盐，在溶解性、吸收性等技术指标上更优，安全无毒，风味良好，应用更加广泛[5].

草鱼鱼鳞中钙的主要存在形式是羟基磷灰石，占鱼鳞质量的30%～50%[6].笔者以草鱼鱼鳞为原料，研究了柠檬酸-苹果酸有机混合酸提取鱼鳞中钙的最佳工艺条件，提高了草鱼鱼鳞资源的利用率，为实际生产提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

草鱼鱼鳞：湖南农业大学生鲜市场；柠檬酸、苹果酸、乙二胺四乙酸二钠、氨水、铬黑T、三乙醇胺：分析纯，国药集团化学试剂有限公司.

1.2 仪器与设备

HH-2 型恒温水浴锅：常州中捷实验仪器制造有限公司；TP-5200B 型电子天平：湘仪天平仪器设备有限公司；101-1A 型电热鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司；PIB02 型电炉：奔腾电器有限公司；ZN-400A 型组织捣碎机：长沙市岳麓区中南制药机械厂.

1.3 试验方案

1.3.1 原料预处理

将草鱼鱼鳞用水冲洗干净，清除黏附在鱼鳞表面上的鱼肉和血污等杂质，烘干后用组织捣碎机捣碎备用.

1.3.2 鱼鳞钙提取单因素试验

分别以液料比（V/M）、温度、柠檬酸和苹果酸的质量比进行单因素试验，观察并分析试验的结果，考察各个因素对钙提取率的影响，从而确定各个因素的适宜区间.

1.3.3 浸酸液中钙含量的测定

采用EDTA 滴定法[7].分别取1、2、3、4、6、8、10 mL 的氯化钙溶液于50 mL 的三角瓶中，均用蒸馏水定容至10 mL.分别在待测溶液中加入3 mL三乙醇胺溶液、5 mL 氨性溶液（NH3-NH4Cl 缓冲溶液）和两滴铬黑-T 指示剂，然后以EDTA 的标准溶液滴定至溶液由紫色变成蓝色，以EDTA 滴定体积和钙浓度作图，得到钙标准曲线的方程：C=0.843 0V+0.121 2，其中，C 为钙离子浓度，V 为EDTA 溶液的滴定体积.

取1 mL 浸酸液加入9 mL 水，分别加入3 mL三乙醇胺、5 mL 氨性溶液（NH3-NH4Cl 缓冲溶液）和两滴铬黑-T，以标准EDTA 溶液滴定至溶液由紫色转为蓝色.再根据钙标准曲线方程计算浸酸液中钙的含量，同时做空白试验.

1.3.4 钙提取率的计算

1.3.5 草鱼鱼鳞有机酸钙提取的二次回归正交试验

采用Box-Behnken 模型，以料液比、温度、柠檬酸和苹果酸的质量比3 个因素为自变量，试验因素编码及水平见表1.

表1 试验因素编码及水平Table1 Code and level of factors for the trail

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对钙提取率的影响

固定酸浓度为8%，反应时间为6 h，提取温度为50 ℃，苹果酸和柠檬酸质量比为1∶1，设定料液比分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20，测定料液比对钙提取率的影响，结果见图1.

图1 料液比对钙提取率的影响Fig.1 Effect of the liquid to material ratio on the extraction rate of calcium

由图1 可以看出，随着料液比的增大，钙提取率增大，在料液比小于1∶15 时，钙提取率的增加较为显著，而在达到1∶15 之后，趋势较为平缓，提取率没有明显变化.浸酸液比例较大时，鱼鳞能与浸酸液充分接触，钙的提取效果较好，而浸酸液比例较小时，钙提取效果较差，这是由于浸酸过程中伴随着少量蛋白类物质溶出，浸酸液少的情况下溶液黏度提升更为明显，不利于鱼鳞与浸酸液充分接触反应，影响了钙的提取，这与黄煜等[8]的研究结果相同.综合考虑，选取以1∶15 为中心的区间进行响应面优化.

2.1.2 温度对钙提取率的影响

固定酸浓度为8%，反应时间为6 h，料液比为1∶15，苹果酸和柠檬酸质量比为1∶1，设定提取温度为50、60、70、80 ℃，测定提取温度对钙提取率的影响，结果见图2.

图2 温度对钙提取率的影响Fig.2 Effect of the temperature on the extraction rate of calcium

由图2 可以看出，随着提取温度的升高，钙提取率逐渐增大，当温度超过60 ℃时，钙提取略微降低.可能由于有机酸的热不稳定性导致与鱼鳞反应的酸溶液减少，从而影响了钙提取，所以选择以60 ℃为中心的温度区间进行响应面优化.

2.1.3 柠檬酸和苹果酸的质量比对钙提取率的影响固定酸浓度为8%，反应时间为6 h，料液比为1∶15，温度为50 ℃，设定苹果酸与柠檬酸的质量比分别为3∶1、2∶1、1∶1、1∶2 和1∶3，测定酸配比对钙提取率的影响，结果见图3.

图3 苹果酸与柠檬酸质量比对钙提取率的影响Fig.3 Effect of the malic acid to citric acid ratio on the extraction rate of calcium

由图3 可以看出，在苹果酸与柠檬酸质量比为1∶1 时，钙提取率最高，不同的苹果酸与柠檬酸配比提取的钙盐组分不同，而柠檬酸-苹果酸复合钙盐更易溶出，为了进一步提高钙提取率，选择以苹果酸与柠檬酸质量比1∶1 为中心的区间进行响应面优化.

2.2 响应面优化试验结果

中心组合试验的试验方案以及试验结果见表2，方差分析见表3，回归模型各影响系数项的显著性检验结果见表4.

表2 试验结果Table 2 Experiment result

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model

表4 回归方程系数显著性检验Table 4 Significance test of regression coefficient

通过Design Expert 8.0 对表2 的试验数据进行多元回归拟合，建立钙提取率（Y）的二次响应面回归模型，得到的钙提取率（Y）对自变量液料比（X1）、温度（X2）、苹果酸与柠檬酸质量比（X3）的回归方程为：Y=8.24+0.32X1+0.039X2+0.12X3+0.25X1X2-0.66X1X3-0.097X2X3-0.35X12-1.18X22-0.49X32.

由表3 可知，交互项的概率为0.504 3（＞0.05），说明交互项对钙提取率的影响不显著；二次项和总模型的概率小于0.000 1，说明二次项对钙提取率的影响极其显著，且此总模型极其显著；失拟项F 值为5.03（＜F0.05），P 值为0.088 0（＞0.05），说明模型的拟合度较好，失拟项不显著，试验的误差较小.

由表4 可知，对钙提取率影响极其显著的因子为料液比（P=0.000 3＜0.01），影响显著的因子为苹果酸与柠檬酸质量比（P=0.042 8＜0.05），影响不显著的因子为温度（P=0.442 1＞0.05）.

2.3 响应面分析（图4—图6）

图4 液料比和温度对钙提取率的影响Fig.4 Effect of the liquid to material ratio and temperature on the extraction rate of calcium

图5 液料比和苹果酸与柠檬酸质量比对钙提取率的影响Fig.5 Effect of the liquid to material ratio and the mass ratio of malic acid to citric acid on the extraction rate of calcium

图6 温度和苹果酸与柠檬酸质量比对钙提取率的影响Fig.6 Effect of the mass ratio of malic acid to citric acid and temperature on the extraction rate of calcium

由图4 可以看出，图中等高线的形状略呈扁平状，表示温度和液料比交互作用显著[9].在相同液料比下，随着温度的升高，钙提取率先升后降，这是因为鱼鳞中的钙在反应中以苹果酸钙、柠檬酸钙、柠檬酸-苹果酸复合钙的形式溶出，温度过高会导致钙盐的水溶性下降，随着温度的升高，化学反应速率加快，柠檬酸由于热稳定性较低，会发生其他化学物质反应，降低了钙提取率.这与刘洪玲等[10]研究结论中关于提取温度的试验数据的趋势是相同的.相同温度下，钙提取率随着液料比的增大而提高，最后趋近一个定值，反应趋于完全.

由图5 可以看出，图中等高线的形状呈扁平状，表示苹果酸与柠檬酸质量比和液料比的交互作用对钙提取率的影响较为显著.不同的液料比下，苹果酸与柠檬酸质量比的最优水平不同，可能由于提取的钙为柠檬酸-苹果酸复合钙盐，而目前尚未完全定义其化学分子式，有机酸的反应也较为复杂，还需进行更深一步的试验探究.李淑芳等[11]提出了对柠檬酸-苹果酸钙分子式的假设并初步证明了其组分中苹果酸根与柠檬酸根的物质的量的比为2∶1，换算成质量比与本试验得出的最优水平相接近.

由图6 可以看出，图中等高线的形状呈椭圆形，但较为偏向圆形，表示温度和苹果酸与柠檬酸质量比的相互作用对钙提取率的影响不显著.在相同温度下，钙提取率随着苹果酸在混酸中比例的增加先升后降，这是由于高钙提取率时对应的酸的配比能够产生较多的柠檬酸-苹果酸复合钙盐，而复合钙盐的水溶性是强于柠檬酸钙和苹果酸钙的，同时苹果酸的酸性强于柠檬酸，苹果酸钙的水溶性也强于柠檬酸钙，所以钙提取率呈先升后降的趋势.

3 结论

（1）根据响应面中心组合设计进行试验得出的结果表明，利用柠檬酸和苹果酸提取草鱼鱼鳞中可溶性钙的最佳工艺条件为：液料比为18.5∶1，提取温度为61 ℃，苹果酸与柠檬酸的质量比为1.1∶1.

（2）经试验验证，上述工艺条件下，钙提取率为8.56%，与理论的预测值8.42%非常接近，试验值与理论值吻合较好，该模型可靠性较高.

（3）由显著性检验和响应面分析可知，液料比对钙提取的影响极其显著，温度对钙提取率的影响不显著，苹果酸与柠檬酸质量比对钙提取率的影响显著.液料比和温度的交互作用对钙提取率的影响显著，液料比和苹果酸与柠檬酸质量比的交互作用对钙提取率的影响极其显著，温度和苹果酸与柠檬酸质量比的交互作用对钙提取率的影响不显著.

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