纳米伊曲康唑药代动力学特性初步研究

李瑞芳，刘 帅，杨硕晔，苏兰利

（河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001）

0 引言

真菌种类繁多、分布广泛.虽然致病性真菌仅占少数，但危害巨大[1-3].目前深部真菌感染在临床上已经上升为第三大感染性疾病[4].近年来，由于广谱抗生素、免疫抑制剂、肾上腺皮质激素的广泛使用和侵袭性操作的开展，以及HIV/AIDS、移植手术、癌症等，对真菌抵抗能力减弱的免疫缺陷患者增多[5]，深部真菌感染的发病率呈上升趋势，病死率高.唑类药物是治疗深部真菌感染的首选药物，氟康唑是目前最常用的药物，但其在应用过程中不断出现耐药，尤其是光滑念珠菌与克柔念珠菌，对氟康唑有天然耐药性[6].伊曲康唑（Itraconazole）很少耐药[7]，但由于水溶性和生物利用度低，临床应用受到限制.伊曲康唑在pH 7 环境下水溶性低（大约1 ng/mL）[8-9]，酸性基质利于其溶解（pH 1 环境下为4 μg/mL），因此伊曲康唑常见用药方式为口服.但口服给药不适用于有恶心、呕吐、胃肠道疾病患者和化疗患者，因此注射针剂研究对扩大伊曲康唑用药途径具有重要意义.

药物的纳米剂型是一种新剂型，通常以两亲性高分子化合物为载体，与药物以一定方式结合在一起，形成粒径在500 nm 以内的纳米粒（nanoparticles，NP），纳米球（nano-spheres，NS），纳米囊（nano-capsules，NC）等，也可以直接将原料药物加工制成纳米粒[10-11].与传统分子药物相比，纳米药物粒径小，既能溶于水，又能克服生物屏障进入细胞，实现高疗效[12]；比表面积大、链接或载带的功能基团或活性中心多，可以实现治疗与疗效跟踪同步化；具有多孔、中空、多层等结构特性，易于实现药物缓释控制等.因此，在保证药效的前提下，由于药物用量减少，可以减轻药物的毒副作用，较易实现低毒性[13-14].本研究旨在研究伊曲康唑纳米粒在小鼠体内代谢动力学变化，为伊曲康唑注射针剂的研发奠定理论基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料

伊曲康唑、DMSO：美国sigma 公司；聚合物5kPEGCA8:加利福尼亚大学戴维斯分校生化与分子医学系Dr.Lam 实验室；氯仿:分析纯，苏州津纯化工有限公司；乙腈:HPLC 纯，VBS 公司；昆明小鼠:18～22 g，雌雄各半，河南省实验动物中心.

1.2 仪器设备

Waters 2695 高效液相色谱:美国沃特世公司;配置2475 荧光检测器，Symmetry C18 色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）.

1.3 试验方法

1.3.1 荧光-HPLC 色谱条件

流动相为乙腈-水（9∶1），流速1 mL/min，柱温40 ℃，激发波长259 nm，发射波长365 nm，进样量10 μL.

1.3.2 血药的提取方法

小鼠眼眶取血0.8 mL，4 500 r/min 离心15 min，取上清血浆200 μL 于1.5 mL EP 管中，加入DMSO 50 μL，涡旋振荡0.5 min；加入乙腈350 μL，涡旋3 min.将涡旋后的样品12 000 r/min 离心10 min，上清液即为含有伊曲康唑的溶液.

1.3.3 血药标准曲线的绘制

称取伊曲康唑原药1.44 mg，用DMSO 定容至100 mL，配制成初始浓度为14.4 μg/mL 的伊曲康唑标准品溶液.取适量加入血浆内，使终浓度分别 为36 ng/mL、144 ng/mL、576 ng/mL、2 304 ng/mL 和9 216 ng/mL，再将伊曲康唑从血浆中重新提取出来，进行荧光-HPLC 分析，以伊曲康唑浓度y（mg/mL）为纵坐标，出峰面积x 为横坐标，按加权最小二乘法进行回归，得到的回归方程即为血药浓度标准曲线.

1.3.4 血药提取回收率、方法回收率和精密度试验[15]

血药提取回收率：空白小鼠血浆中分别加入适量伊曲康唑标准品溶液，配成伊曲康唑浓度分别为36 ng/mL、288 ng/mL、2 304 ng/mL 的低、中、高3 个浓度质控（QC）血样各5 份，重新提取血浆中的伊曲康唑，取10 μL 进行荧光-HPLC，得伊曲康唑峰面积A1.另用DMSO 配制相应浓度的伊曲康唑标准液，不经处理，直接取10 μL，进行荧光-HPLC，得伊曲康唑峰面积A2.

伊曲康唑的血药回收率=A1/A2×100%.

方法回收率：将血药提取回收率试验中得到的伊曲康唑峰面积A1代入回归方程，求出伊曲康唑浓度.

方法回收率=（测得量/加入量）×100%.

血药精密度试验：取上述低、中、高3 个浓度质控血样，于试验的第1 天，将质控血样中血药含量分别测定5 次，得日内相对标准偏差（RSD）；然后将质控血样中血药含量连续测定5 d，得日间RSD.

RSD=（标准偏差/浓度平均值）×100%.

1.3.5 伊曲康唑纳米粒制备

采用薄膜扩散法[16]制备伊曲康唑纳米粒：称取伊曲康唑原药2 mg，多聚物5kPEGCA8 20 mg，用1 mL 氯仿溶解，置于10 mL 单颈圆底烧瓶中，旋转蒸发仪中旋转蒸发约15 min，转速为240 r/min，真空压下降到1.3 MPa 后，维持20 min，抽干残余氯仿.用pH 7.0 的0.02 mol/L 1 mL PBS 缓冲液溶解圆底烧瓶瓶壁上的膜状物，所得混悬液用0.22 μm滤膜过滤，滤液即为伊曲康唑纳米粒混悬液.

1.3.6 纳米伊曲康唑血药和组织样品收集与药物提取

取36 只小鼠，按30 mg/kg 尾静脉单剂量注射纳米粒型伊曲康唑，于给药后0 min、20 min、40 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h各取3 只，眼球采血，脱颈法处死，取组织.

血液药物提取：按1.3.2 中方法提取.

组织药物提取：取组织（肝、肾、脾）以蒸馏水冲洗表面，擦干，称质量，加入研钵中研磨成匀浆，加入200 μL 0.02 mol/L PBS 缓冲液（pH 7.0），混匀，加入DMSO 50 μL，涡旋振荡0.5 min；加入乙腈350 μL，涡旋3 min.将涡旋后的样品12 000 r/min，离心10 min.上清液即为组织伊曲康唑样品.

1.3.7 纳米伊曲康唑药物代谢动力学曲线及参数测定

将制备的血药样品和组织药物样品各10 μL进行荧光-HPLC 色谱分析，结果代入血药标准曲线回归方程，测出不同时间点的药物浓度；将各时间点药物浓度的平均值代入药代动力学软件WinNonlin 进行处理，计算主要药代动力学参数如曲线下面积（AUC0-∞）、半衰期（t1/2z）、达峰时间（Tmax）、最大血药浓度（Cmax）等.

2 结果与分析

2.1 伊曲康唑的荧光-HPLC 色谱行为

伊曲康唑标准品（3.2 μg/mL）、空白血浆、含药血浆（小鼠静脉注射伊曲康唑纳米粒20 min 后的血浆样品）进样后的色谱见图1.

由图1 可知，小鼠血浆内源性物质不干扰伊曲康唑的测定，伊曲康唑的保留时间为3.415 min.

2.2 血药标准曲线

以伊曲康唑浓度y（mg/mL）为纵坐标，出峰面积x 为横坐标，按加权最小二乘法进行回归，得到标准曲线：y=0.005x+29.52，R2=0.999，线性范围36～9 216 ng/mL.

2.3 血药提取回收率、方法回收率与精密度试验

为判断血浆中伊曲康唑提取前后浓度偏差程度，测定血药提取回收率；为判断血药标准曲线的正确性，测定方法回收率；为判断日内和日间样品浓度重复性，测定日内精密度和日间精密度，结果如表1 所示.由表1 可知，RSD 均小于15%，方法符合样品分析要求，稳定可靠[15].

图1 伊曲康唑血浆样品荧光-HPLC 色谱Fig.1 The analysis of itraconazole in plasma by fluorescence-HPLC

表1 回收率和精密度测试结果(x±s，n=5)Table 1 Results of recovery rate and precision tests(x±s,n=5)

2.4 伊曲康唑药物代谢动力学曲线及参数

将样品进行荧光-HPLC，测出不同时间血液和组织药物浓度.血液药物浓度-时间曲线见图2，组织药物浓度-时间曲线见图3.由图2 和图3 可知，纳米粒型伊曲康唑给药后，伊曲康唑迅速分布到各个脏器组织，前15 h 在各组织药物分布较为均匀，具有相似的代谢动力学变化.有趣的是，伊曲康唑在血液和各组织中的含量于给药24 h 后，又有轻微回升，大致趋势为脾脏药物含量＞肾脏药物含量＞心脏药物含量.出现此结果，是否与纳米剂型有关，需要进一步研究.三唑类药物为时间依赖性抗菌药物，作用效果主要取决于血药浓度高于MIC 的时间，其峰浓度并不很重要[17].伊曲康唑对白色念珠菌的MIC90 为0.5 μg/mL[18-20]，本研究中，伊曲康唑在体内的含量超过白色念珠菌MIC的时长分别为：血液，12 h；肾，31 h；脾，46 h；心，23 h，说明伊曲康唑纳米粒进入体内能长时间发挥抗菌作用.

图2 血浆中伊曲康唑的浓度-时间曲线Fig.2 The concentration-time curve of itraconaloze in plasma

将不同时间点药物浓度的平均值输入Win-Nonlin 软件进行分析，计算主要药代动力学参数，所得数据见表2.

图3 各脏器中伊曲康唑的浓度-时间曲线Fig.3 The concentration-time curves of itraconazole in visceral organs

表2 伊曲康唑纳米粒在血浆中的药代动力学参数Table 2 The pharmacokinetic parameters of itraconazole in plasma

时晔等[21]制备的纳米伊曲康唑AUC（0-∞）为8 710（μg·h）·L-1、Cmax为2 040 μg·L-1、t1/2为25.08 h；缪海军等[22]制备的纳米伊曲康唑AUC（0-∞）为（1 414.0±815.2）（μg·h）·L-1、Cmax为（81.4±60）μg·L-1、t1/2为（29.3±5.62）h；丁艳等[23]制备的纳米伊曲康唑AUC（0-∞）为9 800（μg·h）·L-1、Cmax为1 322 μg·L-1、t1/2为69.315 h；王伟[24]制备的纳米伊曲康唑AUC（0-∞）为（21 129.13±1 745.025）（μg·h）·L-1、Cmax为（632.92±46.84）μg·L-1、t1/2为（18.246±1.017）h.与文献相比，文中制作的伊曲康唑纳米粒的AUC（0-∞）、Cmax更高，Tmax小，说明小鼠对纳米粒的吸收程度大，药效强，但代谢快，原因可能是以5kPEGCA8 为载体的纳米伊曲康唑溶解度增加，代谢加快.

3 结论

本研究以多聚物5kPEGCA8 作为包裹物，用薄膜扩散法制备伊曲康唑纳米粒，采用荧光-HPLC法测定纳米粒的药代动力学特性，成功制备了伊曲康唑静脉注射剂型，为伊曲康唑注射针剂的开发提供了参考.

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