降钙素原（PCT）单克隆抗体的制备及其在血清学检测中的应用

王云龙，胡俊峰，李玉林，王继创，程 蕾

（1.河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001；2.河南省生物工程技术研究中心，河南 郑州 450001）

0 前言

降钙素原（PCT）编码基因定位于人类第11 号染色体，该基因由6 个外显子和5 个内含子组成，总长约7 600 bp，其中编码区长度为2 800 bp.基因转录后在甲状腺滤泡旁细胞粗面内质网内翻译成降钙素原前体，进而在内源多肽酶的作用下修饰加工，生成116 个氨基酸的终产物PCT[1].PCT可由细胞内特殊蛋白酶分解生成降钙素，这种肽类激素对人体有重要的调节作用.正常情况下，PCT 在血清中的含量非常低，仅为10～50 pg/mL，然而在系统炎症反应综合症、败血症、急慢性肺炎、急性胰腺炎等细菌性感染的患者血清中PCT水平显著升高，其浓度可达正常水平的几千倍甚至上万倍，而在局部感染、病毒感染、慢性非特异性炎症等患者的血清中PCT 浓度不增加或轻微增加，这就决定了PCT 相较于其他血清标志物而言具有高度的特异性[2]，可作为细菌感染的特异性指标，用于细菌类疾病的鉴别诊断[3]，为医生是否使用抗生素提供有价值的参考.不仅如此，由于PCT的浓度和疾病的严重程度呈正相关，并随着病情的发展变化而变化，因此PCT 又可作为判断病情与愈后以及疗效观察的可靠指标[4]，医生可以通过监测PCT 的变化从而观察抗生素的治疗效果，使患者及时得到针对性治疗，缩短治疗周期、减少治疗费用[5]，因此早期PCT 的定量检测临床意义重大，也正是开展本研究的目的所在.与其他PCT 检测方法相比，ELISA 酶免检测方法具有较高的敏感性和特异性、成本低、检测时间短、无污染[6]，可在大多数基层医院使用[7].因此本研究制备了PCT 高特异性的单克隆抗体并且建立了PCT 的双抗体夹心ELISA 定量检测方法.

1 材料和方法

1.1 材料

PCT 抗原以及PCT 酶标抗体由河南省生物技术研究中心提供；47 份细菌感染血清标本、38 份健康人血清标本、50 份PCT 临床阳性血清标本由郑州大学第一附属医院鉴定（罗氏电化学发光法）并提供；PCT 线性参考品（P1=10 ng/mL、P2=5 ng/mL、P3=2 ng/mL、P4=1 ng/mL、P5=0.5 ng/mL）.精密性质控品为6 ng/mL 均由河南省生物工程技术研究中心提供，所有标本无溶血、常规传染病（HN、HCV、HBV）检测阴性；其他常规化学试剂均为分析纯.

1.2 方法

1.2.1 PCT 单克隆抗体的制备

选取6～8 周龄，体质量17～21 g 的Balb/c 小鼠，每只小鼠分别经皮下多点注射PCT 抗原混合等体积的弗氏完全佐剂.首次免疫4 周后进行第二次免疫，加等体积的弗氏不完全佐剂，7 d 后再加强免疫一次.然后取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株sp2/0 细胞按常规方法融合，经间接ELISA 筛选，有限稀释法获得单克隆化细胞株后，按常规方法制备腹水从而制备大量的PCT 单克隆抗体[8].

1.2.2 PCT 单克隆抗体的特性鉴定

使用Western-blot 法，取PCT 抗原进行SDSPAGE，并转至PVDF 膜，封闭，依次滴加杂交瘤细胞的培养上清及HRP 标记的羊抗鼠IgG，显色后观察是否有特异性条带.

1.2.3 PCT 双抗体夹心ELISA 定量检测方法的建立

1.2.3.1 包被液的选择及条件优化

根据本实验室经验选用常用的0.01 mol/L PB（pH7.2）、0.05 mol/L CB（pH9.6）两种包被缓冲液，分别在37 ℃和4 ℃通过不同时间包被来进行包被条件的优化试验，并得出最佳包被条件.

1.2.3.2 封闭液的选择及条件优化

封闭液的选择：选用常用的0.3%BSA、0.6%BSA、1%BSA 3 种不同浓度进行对比；封闭时间及温度的选择：37 ℃下1、2、4 h；4 ℃下12、18、24 h.同样用已知的线性参考品进行封闭条件试验比较，得出最佳封闭条件.

1.2.3.3 包被抗体和酶标抗体最佳工作浓度的确定

包被抗体浓度选择：300、400、500 ng/mL.酶标抗体浓度选择：1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000.分别用线性参考品进行棋盘滴定检测.

1.2.3.4 反应模式和反应时间的确定

选用两步法模式，在两步法中选择模式一（30 min+30 min+20 min）、模式二（60 min+30 min+20 min）、模式三（60 min+60 min+20 min）3 种方式进行试验.用已知线性参考品进行检测，根据结果分析确定最佳反应模式.

1.2.3.5 线性考察

通过已建立的PCT 检测方法对线性参考品进行检测.以OD 值为纵坐标y，参考品浓度为横坐标x，建立标准曲线.

1.2.4 临床样品考核

1.2.4.1 灵敏度和特异性的试验

用已建立的方法来检测136 份细菌性感染病人血清和90 份病毒性感染病人血清，通过结果来考察本方法的灵敏度和特异性.

1.2.4.2 临床标本对比检测试验

罗氏PCT 试剂盒作为本检测方法的参照试剂盒，用建立的ELISA 双抗体夹心检测方法与罗氏PCT 试剂盒对比检测50 份PCT 定值血清标本，评价制备的PCT 双抗体夹心ELISA 检测方法.

2 结果与讨论

2.1 PCT 单克隆抗体的制备和鉴定

经细胞融合、筛选及克隆化，获得8 株能稳定分泌抗PCT mAb 的杂交瘤细胞株，Westem-blot 显示，所有杂交瘤细胞株的培养上清能同时检测到PCT 抗体，表明这8 株单克隆抗体可特异地识别PCT.

2.2 包被液的选择及条件优化

表1 显示：当包被液选择用0.05 mol/L pH 9.6 的CB 缓冲液时其R2值及P5 检测值均高于0.01 mol/L 的pH7.2 的PB 缓冲液.而且包被的温度和时间设定为4 ℃下包被12 h 要优于37 ℃下包被4 h.因此最终确定0.05 mol/L，pH9.6 的CB缓冲液在4 ℃条件下包被12 h 最有利于PCT 的检测.

表1 不同包被条件下血清样品检测结果Table 1 Detection results of serum samples coated under different conditions

包被液的pH、离子强度、包被反应时间及包被环境温度的不同会影响固相载体对蛋白的吸附能力.由表1 可以看出，包被缓冲液偏碱性有利于该抗体与包被板的吸附.包被时间过短不利于包被抗体的吸附.包被温度选择上，低温和高温的结果虽然相近，但是高温可能会对包被抗体的活性造成的影响是试验中必须考虑的因素.从生产工艺上考虑，4 ℃包被12 h，包被间隔期可以选择晚上，不会影响生产进度，所以选择低温包被12 h.

2.3 封闭液的选择及条件优化

由表2 可以看出，用0.6% BSA 在37 ℃下封闭2 h 其R2值（0.996 8）及P5 检测值（0.123）符合要求，能够有效封闭包被板中未被目标抗体结合的蛋白位点，避免假阳性现象的出现.因此研究选择封闭条件为0.6% BSA 在37 ℃下封闭2 h.

表2 不同封闭条件下血清样品检测结果Table 2 Detection results of serum samples closured under different conditions

根据表2 选择了37 ℃下封闭2 h，原因一：37℃下的R2和P5 值都较好，符合试验要求.原因二：时间上可以大幅减少，试验进度不会拉长.原因三：封闭完成之后紧接着就进行下一步的试验或者存冷库保存，抗体活性与4 ℃下相比几乎没有区别.

2.4 最佳抗体包被浓度和酶标浓度的确定

表3 结果显示：400 ng/mL 的抗体包被浓度与1∶8 000 酶标二抗浓度配对效果最好，其检测结果P5=0.148，R2=0.993 5，满足试验要求.因此选择最佳的包被抗体浓度为400 ng/mL，最佳酶标抗体浓度为1∶8 000.

表3 不同样品稀释度条件下血清样品检测结果Table 3 Detection results of serum samples diluted under different conditions

2.5 反应模式和反应时间的确定

由表4 可知，两步法线性关系良好，模式一的反应模式线性范围更宽，R2＞0.98，符合研究要求，并在总体上检测时间比其他模式所需要的时间更少.因此，综合判断结果，将模式一作为本研究的检测模式.

表4 不同反应模式下血清样品的检测结果Table 4 Detection results of serum samples under different response modes

由表4 可知，虽然模式二和模式三的线性也符合试验要求，但是在确保标准品P5 检出值符合要求的前提下，综合3 种模式的检测线性范围，模式一的线性范围更宽，而且模式一在整体检测时间上得以缩短，只需要90 min，提高了检测的效率，因此选择模式一.

2.6 线性考察结果

通过建立起的线性参考品绘制曲线（图1）可见，PCT 浓度在0.5～10 ng/mL 范围中呈线性关系，R2≥0.98 符合试验要求.

图1 PCT 线性曲线Fig.1 PCT linear diagram

2.7 临床灵敏度和临床特异性

使用本研究中建立的PCT 双抗体夹心ELISA定量检测方法检测136 例临床确诊为细菌感染性疾病的患者，136 例检测结果PCT 大于2 ng/mL，灵敏度达到95.6%，另外检测90 例病毒感染血清，88例呈阴性，特异性为97.8%，结果见表5.

由表5 可以看出，在阳性临床血清检测中本PCT 酶免检测方法的灵敏度达到95.6%，在阴性临床血清检测中特异性达到了97.8%，因而本试验建立的方法在临床检测中具有较高的敏感性和特异性.

2.8 临床标本对比检测试验

与罗氏试剂盒对比，验证本研究中建立的PCT双抗体夹心ELISA 定量检测方法的检测效果.将大于10 ng/mL 含量的血清按一定比例倍比稀释后分别用这两种方法进行检测.

表5 PCT 定量检测方法的灵敏度和特异性分析Table 5 The sensitivity and specificity of the quantitative method of PCT

图2 相关性对比检测曲线Fig.2 Linear diagram of the correlation results

图2 结果显示，R2值为0.967 0，二者相关性良好，本试验建立的PCT 双抗体夹心ELISA 定量检测方法达到了较高的水平.

临床上抗生素的合理应用是人们十分关注的问题.抗生素的滥用不仅对病情治疗毫无帮助，反而会延误病情，对人体产生毒副作用，增加细菌耐药性，加重病情甚至造成二重感染[9]，而多数医生在抗生素应用上依靠自身经验[10]，因缺乏客观指标往往很难把握.PCT 作为细菌感染的特异性指标[11]，不仅可以作为是否使用抗生素的参考指标和依据，还可以通过监测病人PCT 的变化从而观察抗生素的治疗成效，给抗生素的应用提供科学指导[12].因此，建立灵敏特异，可靠性强的PCT 血清学定量检测方法尤其重要.

本试验室通过酶联免疫技术建立了PCT 定量检测方法.与PCT 胶体金检测技术相比，克服了胶体金技术不能定量检测血液中PCT 含量的缺点，PCT 酶免检测技术能够准确地检测血液中PCT 含量，并能够监测PCT 含量的变化情况，给临床诊断提供可靠的依据.与PCT 化学发光检测技术相比，PCT 酶免检测方法成本低，对检测人员技术要求不高，能够满足大多数基层医院的需求.

3 结论

本研究制备了PCT 特异性的单克隆抗体进而建立了基于ELISA 的PCT 定量检测方法.经试验确定的反应条件和参数为：包被液选择4 ℃下pH 9.6 的0.05 mol/L CB 包被12 h，封闭液选择37 ℃下0.6%BSA 封闭2 h，包被浓度为400 ng/mL，酶标浓度为1∶8 000，所能定量的线性范围为0.5～10 ng/mL，灵敏度95.6%，特异性97.8%.该方法与罗氏试剂盒对比检测的结果显示两者相关性R2=0.967 0.所以本研究建立的PCT 双抗体夹心ELISA 定量检测方法灵敏度高，特异性强，具有潜在的商业应用价值.

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