从全基因表达谱角度探讨理冲汤抑制人子宫肌瘤细胞的作用机制

韩虹娟 李冬华 钱睿亚 许昕 黄玉华 倪婧 张武芳 耿建国 赵文景

子宫肌瘤(uterine leiomyoma)是女性生殖系统最常见的良性肿瘤，育龄期妇女发生较多，发病年龄多为30 ～50 岁，根据部位的不同，其症状以阴道出血、腹部包块、白带增多、疼痛及不孕不育等为主，严重影响妇女的生活质量。迄今为止，子宫肌瘤的发病原因、病理机制尚不十分明确。西医一般认为，其发生发展与雌、孕激素及其受体、生长因子、细胞凋亡、癌基因与抑癌基因、细胞免疫等有关［1］。中医多认为子宫肌瘤的发生与正气不足、瘀血内停有关，治疗多选用扶正祛瘀法，且效果显著。本研究旨在通过观察扶正祛瘀法的代表方——“理冲汤”对体外培养人子宫肌瘤细胞基因表达谱变化的调控为切入点，探讨理冲汤抑制肌瘤生长的分子机制，为临床治疗提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 组织来源

取自北京妇幼保健院行子宫肌瘤剔除术的患者，将切除的肌瘤组织部分送病理检查，选择肌瘤组织中间部分做子宫肌瘤原代细胞培养。该患者在手术前3 个月未接受过激素和其他药物治疗，术后病理诊断为肌壁间肌瘤。

1.2 主要试剂和仪器设备

DMEM 培养基(Gibco 公司，批号:NXCO586);胎牛血清(Hyclone 公司，批号:608759);0.25%胰酶(Hyclone 公司，批号:T1300-100);I 型胶原酶(Gibco 公 司);PBS 液(Hyclone 公 司，批 号:NYE0891);TRIZOL 试剂(Invitrogen life technologies，USA，批号:66314);GeneChip(r)PrimeViewTMHuman Gene Expression Array(Affymetrix，USA);GeneChip®3'IVT Express Kit(Affymetrix，USA);Gene-Chip ® Hybridization，Wash，and Stain Kit (Affymetrix，USA);RNA 提取试剂盒(QIAGEN);基因芯片洗脱工作站(GeneChip Fluidics Station 450);基因芯片杂交炉(GeneChip Hybridization Oven 645);基因芯片扫描仪(GeneChip Scanner 3000 7G);PCR 仪(ABI geneAMP® PCR system 7500)。

1.3 药物血清制备

1.3.1 材料 实验动物:3月龄SD 大鼠24 只，雌性未孕，体质量(220 ±20)g，SPF 级。购自首都医科大学实验科学动物部，合格证号为SCXK(京)2012-0001，饲养在首都医科大学实验动物部SPF 级动物室，正常光照条件，食、水可自由摄取，室温控制在18 ～22℃之间。随机将其分为空白对照组，理冲汤组，每组各12 只。

1.3.2 动物灌服药物的制备 中药煎煮:理冲汤(生黄芪9 g、党参6 g、白术6 g、生山药15 g、天花粉12 g、知母12 g、三棱9 g、莪术9 g、生鸡内金9 g)，上述中药饮片均购自北京同仁堂饮片有限责任公司。煎熬过程:按上述处方量取中药饮片，先后水提2 次。第一次加药材8 倍量水浸泡0.5 小时，煎煮1 小时，煎至将成，加陈醋少许［2］;第二次加药材的6 倍量水煎煮1 小时，煎至将成，加陈醋少许，合并煎液，过滤，减压浓缩制成含生药2.28 g/mL 的药液，低温(0 ～4℃)保存，用前摇匀。

1.3.3 给药方法 理冲汤组每天灌服中药用量为9.12 g/kg，为成人等效剂量，同时空白对照组的大鼠每天灌以等量生理盐水。连续给药3 天，每天分2 次灌服。

1.3.4 血清采集 取血之前禁食12 小时，末次给药2 小时后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，行心脏取血，3000 r/min、20 分钟离心分离血清。将同组内的血清混合，56℃、30 分钟灭活，0.22 μm 微孔滤膜除菌后分装，-80℃保存备用。

1.4 细胞培养及给药方法

1.4.1 细胞原代培养 将子宫肌瘤组织剪碎至1 cm3大小，置于20 mL 含3%双抗(青链霉素)的PBS 中，密闭冰浴运输。用含3%双抗的PBS 液对组织进行梯度清洗，在漂洗的过程中尽可能的去除血迹及组织外层可能被污染及坏死的部分;漂洗好后，用无菌吸管将组织小块及其无血清培养基一起吸入到离心管中，待组织沉淀，弃上清，向管中加入0.2% I 型胶原酶10 mL，37℃水浴消化1.5 ～2 小时后，加入足量的完全培养基终止消化，离心、弃上清，再用70 μm 细胞筛过滤，收集滤液，加入适合浓度的完全培养基接种细胞于培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱中进行孵育培养。以后每3 天换液1次。待细胞融合度达80%后，传代。

1.4.2 含药血清干预 取第三代细胞消化，调整细胞浓度至1 ×107/L，1 mL/孔，接种于24 孔细胞培养板内，分为空白对照组、理冲汤组。培养12 小时，待细胞贴壁，PBS 液清洗，空白对照组加入含20%无药血清培养液1 mL，理冲汤组每孔加入20%理冲汤含药血清［3］的培养液1 mL，37℃，5%CO2培养箱中培养48 小时。

1.5 实验方法

含药血清干预子宫肌瘤细胞培养48 小时后，吸弃培养液，PBS 清洗，每孔加入100 μL 的Trizol，反复吹打，目视细胞层裂解完全，吸至冻存管中，-80℃保存，干冰运输，运用基因芯片表达谱检测法(Affymetrix GeneChip PrimeViewTM Human Gene Expression Array)取待测样品，进行样品的RNA 抽提及纯化，采用紫外吸收测定法及变性琼脂糖凝胶电泳进行RNA 质量检测，合成cDNA，最后运用实时定量PCR 进行验证。

1.6 统计学处理

基因芯片所有数据上传并进行归一化处理后运用Two Class Dif 软件分析系统分析差异表达的基因，GO 分析用于确定差异表达基因的主要功能，并根据KFGG 和BioCarta 数据库对差异表达基因进行相关通路分析，RT-PCR 采用ΔΔCt 计算方法。

2 结果

2.1 含药血清干预

将第4 代子宫肌瘤细胞消化成细胞悬液，调整浓度至1 ×105/mL，每孔100 μL 接种于24 孔培养板，分为空白对照组、理冲汤用药组，每组6 个复孔，培养12 小时，待细胞贴壁后，理冲汤组各孔分别加入浓度为20%的含药血清1 mL，空白对照组各孔加入20%无药血清1 mL，37℃、5%CO2培养箱中培养，分别取含药血清干预24 小时、36 小时、48 小时后，用倒置相差显微镜在白场下放大200 倍观察:空白对照组细胞生长未受明显影响，仅有轻度的肥大增生;理冲汤含药血清干预下肌瘤细胞形态随干预时间的变化均出现了明显的改变，细胞胞浆减少并出现不同程度的萎缩，细胞轮廓变小变圆，细胞之间的连接也变得模糊不清，并且出现部分死亡，尤以48 小时达到抑制的高峰，如图1所示。

图1 HE 染色光镜下观察含药血清干预下细胞形态变化

2.2 RNA 质量检测

子宫肌瘤细胞总RNA 提取的样品经紫外吸收测定法检测定量，空白对照组和理冲汤组样品RNA 溶液的A260/A280 的比值均为1.8 ～2.1，各样品中蛋白质杂质少。变性琼脂糖凝胶电泳分析，各组28S 和18S核糖体RNA 的带非常亮而浓，上面一条带的密度大约是下面一条带的2 倍，无其他大分子条带，表明总RNA无蛋白质污染，无降解，结果见表1、图2。

表1 各组RNA 纯化后测的浓度

图2 各组变性琼脂糖凝胶电泳结果

2.3 基因表达谱分析

2.3.1 差异基因分析 根据理冲汤用药组与空白对照组两组间基因表达水平分析，选取P ＜0.05，上调基因Fold change＞1.5 以及下调基因Fold change ＜0.5的差异基因，结果显示，理冲汤组与空白对照组比较后差异表达基因数量为1154 个，其中上调基因630 个，下调基因524 个，见图3、4 所示。

图3 差异基因聚类分析图

图4 部分差异基因的变化值

2.3.2 GO 分析 将筛选出的差异表达基因进行GO 分析(P ＜0.05)发现，富集的GO 功能共有119条，其中上调的差异基因调节的GOs 有45 条，主要涉及信号传导、细胞凋亡的诱导、细胞增殖的负调节、血管生成的负调节等多方面的功能，其中下调的差异基因调节的GOs 有74 条，涉及有细胞周期及分化、细胞黏附的调节、细胞外基质的改变和细胞迁移等方面的相关功能，见图5、6，表2所示。

图5 上调的差异基因调节的部分GOs

图6 下调的差异基因调节的部分GOs

2.3.3 信号通路分析 对差异基因进行信号通路分析(P ＜0.05)，结果显示，差异基因富集的信号通路共有73 条，其中上调的差异基因调控27 条信号通路，包括有细胞凋亡、趋化因子信号通路、白细胞跨内皮迁移、细胞因子及细胞因子受体的相互作用等信号通路;下调的差异基因调控46 条信号通路，包括MAPK 信号通路、Wnt 信号通路、TGF-β 信号通路p53 信号通路、T 细胞受体信号转导途径、PI3KAkt 信号通路、HIF-1 信号传导途径等，见图7、8，表3所示。

图8 下调的差异基因调节的信号通路

2.3.4 实时定量PCR(RT-PCR)验证 选取与子宫肌瘤密切相关的NOS3、SHC1、FN1、ANGPT1 等4个基因进行RT-PCR 验证，结果显示，4 个基因在实时定量PCR 与基因芯片的表达水平趋势一致，故可提示基因芯片的结果基本可靠，见图9所示。

表2 部分差异基因GO 功能注释结果

表3 部分差异基因KEGG 通路注释

图9 基因芯片检测结果与实时定量PCR 结果比较

3 讨论

“理冲汤”出自清代名医张锡纯先生之《医学衷中参西录》，是扶正祛瘀立法治疗子宫肌瘤的代表方，方中党参、黄芪、山药、白术益气健脾;三棱、莪术、鸡内金活血破瘀，消癥散结;天花粉养阴解毒，知母凉润，既可济参芪之热，又可滋肾水之枯。温而不燥，凉而不寒，攻补结合。全方体现了扶正祛邪兼顾，消癥瘕而不伤正，益气血而不碍散癥瘕的宗旨。中医认为子宫肌瘤是“正虚”为本，“血瘀”为标，“本虚标实”是其病机关键，因此，选用具有扶正益气、祛瘀消癥功效的理冲汤是治疗子宫肌瘤的理想方剂。

通过分析子宫肌瘤细胞在理冲汤的干预治疗下基因表达谱的变化，发现与细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bak1在理冲汤的治疗干预下呈现表达下调。B 淋巴细胞瘤白血病-2 蛋白(B-cell lymphoma-2，BCL-2)是一种凋亡抑制基因产物，能够延长细胞的寿命，并且它能通过与雌激素的相互协调，共同导致子宫肌瘤的发生;同时，Palomba 等［4］的研究也证实，肌瘤组织的Bcl-2/Bak 阳性比率显著高于同源的子宫肌层;Bcl-2 表达阳性率高的细胞寿命长、凋亡缓慢，细胞就会堆积导致肿瘤的发生［5］，说明子宫肌瘤的发病机制与细胞增殖和凋亡的过程明显相关，而本课题结果也显示子宫肌瘤细胞在理冲汤的干预下Bcl-2 基因的表达成下调趋势，因此有理由认为，理冲汤抑制子宫肌瘤细胞的生长的作用与调控细胞凋亡的基因表达量下降有关。

子宫肌瘤的发生、发展不仅与细胞的增殖、凋亡调控紊乱有关，也与局部微环境中的血管无序生长有关。如果没有新生血管生成，肿瘤组织将保持休眠状态或发生退化。血管生长因子在肌瘤的病理机制中主要作用于异常血管系统和纤维瘤的生长与存活，而异常的血管新生又是子宫肌瘤细胞得以不断增殖的关键因素，因此，抑制相关血管生长因子的表达，成为了治疗子宫肌瘤的潜在策略［6］。促血管生成素(angiopoietins，Ang)是近年来发现的血管生长因子，主要存在Ang-1、Ang-2、Ang-3 和Ang-4 四种亚型，其中Ang-1 与Ang-2 两者较活跃。Nakayama等［7］运用免疫组化法检测1317 例子宫肌瘤的Ang-1表达，其阳性率为76.5%，结果表明血管生成素在子宫肌瘤的生长、分化中起到重要作用。Ang-1 的作用机制是通过与内皮细胞特异性络氨酸酶受体(Tie-2)结合而诱导自身使之磷酸化，随后促进新生血管周围支持细胞的聚集，降低血管的通透性，从而促进新生血管稳定性的增加。也有文献显示，Ang-1 的促血管生成作用也依赖于基础水平血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达，在人脐静脉内皮细胞和成纤维细胞的共培养系统中，成纤维细胞分泌基础量VEGF，在该系统中加入Ang-1 能促进血管管腔形成，而抗VEGF 和抗VEGFR-2 中和抗体能有效阻断Ang-1 的作用［8］。理冲汤组的基因芯片分析结果显示与血管生成相关的Ang-1 的表达明显下调，并且差异基因富集的信号通路也包括有对肿瘤血管生成起重要调控作用的VEGF信号传导系统，由此可以看出理冲汤治疗子宫肌瘤的作用机制可能与下调Ang-1 的表达，调控血管生成相关信号通路，进而抑制肿瘤血管生成有关。

综上分析，理冲汤对人子宫肌瘤的治疗作用机制主要体现在两个方面。一是，通过对细胞凋亡相关基因Bcl-2 等的表达抑制;二是，通过调控与肿瘤血管生成密切相关的Ang/Tie-2 信号传导通路而实现的。因此，深入研究分析这些基因及其参与的信号传导通路，将有利于进一步了解肌瘤的发病机制，从而能更好、更有目地的筛选预测目标和干预位点，为今后在治疗子宫肌瘤方面提供新的思路。

［1］Munro MG.Uterine leiomyomas，current concepts:pathogenesis，impact on reproductive health，and medical，procedural，and surgical management［J］.Obstet Gynecol Clin North Am，2011，38(4):703-731.

［2］张锡纯.医学衷中参西录［M］.北京:人民卫生出版社，2010:489.

［3］郑九波，李冬华，韩虹娟，等.理冲汤对体外培养人子宫肌瘤细胞增殖和形态的影响［J］.中医药导报，2012，18(10):12-15.

［4］Palomba S，Orio F Jr，Russo T，et al.Antiproliferative and proapoptotic effects of raloxifene on uterine leiomyomas in postmenopausal women［J］.Fertil Steril，2005，84(1):154-161.

［5］Nakashima T，Tanaka R，Yamashita Y，et al.Aranorosin and a novel derivative inhibit the anti2 apoptotic functions regulated by Bcl-2［J］.Biochemical and Biophvsical Research Communications，2008，377(4):1085-1090.

［6］Tal R，Segars JH.The role of angiogenic factors in fibroid pathogenesis:potential implications for future therapy［J］.Hum Reprod Update，2014，20(2):194-216.

［7］Nakayama T，Inaba M，Naito S，et al.Expression of angiopoietin-1，2 and 4 and Tie-1 and 2 in gastrointestinal stromal tumor，leiomyoma and schwannoma［J］.World J Gastrointestinal，2007，13(33):4473-4479.

［8］Saito M，Hamasaki M，Shibuya M.Induction of tube formation by angiopoietin-1 in endothelial cell/fibroblast co-culture is dependent on endogenous VEGF ［J］.Cancer Sci，2003，94 (9):782-790.