山东地区生猪屠宰环节沙门菌毒力基因携带状况分析

刘鲜鲜，王 娟，张 倩，赵建梅，曲志娜，王玉东，孙佳怡，黄秀梅，邹 明，王君玮

（1.青岛农业大学，山东青岛266109；2.中国动物卫生与流行病学中心动物产品安全检测室，山东青岛266032；3.黄岛出入境检验检疫局，山东青岛266555）

山东地区生猪屠宰环节沙门菌毒力基因携带状况分析

刘鲜鲜1，2，王 娟2，张 倩3，赵建梅2，曲志娜2，王玉东2，孙佳怡1，黄秀梅2，邹 明1，王君玮2

（1.青岛农业大学，山东青岛266109；2.中国动物卫生与流行病学中心动物产品安全检测室，山东青岛266032；3.黄岛出入境检验检疫局，山东青岛266555）

为了了解山东地区生猪屠宰环节沙门菌毒力基因携带状况，为进一步开展沙门菌风险评估提供基础数据。采集山东地区5个不同生猪屠宰场样品1 000份，分离沙门菌，鉴定血清型，并对mog A、sse L、spv C、spv R、his J、fli C等6种毒力基因进行PCR检测。结果共分离得到沙门菌菌株188株，分离率为18.8%。鉴定出9种血清型，以德尔卑沙门菌（S.derby）、鼠伤寒沙门菌（S.typhimurium）、汤卜逊沙门菌（S.thompson）为主。上述6种毒力基因均有检出，其中，mog A检出率为76.70%，his J检出率为62.77%，两种毒力质粒spv R、spv C的检出率较低，仅分别为3.19%和1.06%，且同时含有多种毒力基因的沙门菌菌株较少。不同地区屠宰场毒力基因携带状况存在较大差异。表明山东地区生猪屠宰环节沙门菌毒力基因携带状况不同，沙门菌污染较严重，应采取措施降低生猪屠宰中沙门菌的污染，减少食物中毒事件。

猪；屠宰；沙门菌；毒力基因

沙门菌（Salmonella）是一种全球范围内重要的食源性致病菌，主要寄生在人和动物肠道内，感染动物和人后，可引起多种疾病，给人畜健康和公共卫生安全带来严重威胁。沙门菌种类繁多，世界上已发现2 500多种沙门菌血清型，我国发现了292种［1］。其中对人类危害较大的为鼠伤寒、肠炎以及德尔卑沙门菌等［2］。

近年来，食品中毒事件引起了人们的高度关注，据统计，70%-80%的食品中毒事件由沙门菌引起［3］，而猪肉产品作为沙门菌的重要载体，其质量安全倍受关注。生猪屠宰环节由于环节较多，屠宰工具、环境以及人员与猪肉产品频繁接触，是沙门菌污染猪肉产品的源头。

沙门菌致病性是毒力相关因子相互作用的结果，而这些毒力基因主要分布在毒力岛、毒力质粒、鞭毛和脂多糖。目前沙门菌的毒力岛研究比较全面的为SPI1、SPI2、SPI3、SPI4、SPI5。相关研究［4-5］表明，携带SPI1和SPI2与同时携带5种毒力岛的致病性大致相同。故而本研究选择了SPI1的核心蛋白mog A基因和SPI2的核心蛋白sse L基因研究沙门菌毒力基因携带状况。沙门菌毒力质粒spv基因有利于沙门菌在肠外组织细胞内的生长，其产物与细菌的粘附、定植及血清抗性等毒力表型密切相关。spv基因含有spv R、spv A、spv B、spv C、spv D 5个开放阅读框。其中，spv R编码LysR/metR家族转录活化因子的细菌调节性蛋白，并使基因按照合成spv ABCD的方向进行转录，spv C编码-大小为28 ku的蛋白质［6-7］，能够抑制MAP磷酸激酶。沙门菌鞭毛蛋白可引起强烈的免疫应答，是沙门菌重要的致病因素，由fli C或fli B编码。his J为组氨酸转运基底结合蛋白，可使组氨酸降解成氨，影响组氨酸的合成。

本研究从生猪屠宰环节采集样品，研究山东生猪屠宰环节中沙门菌的污染以及毒力基因携带状况，初步了解猪肉产品较易出现交叉污染的环节，毒力基因的毒力强弱，以期制定减少强致病性沙门菌污染的措施，降低流通至市场的猪肉产品沙门菌污染率，保障猪肉产品的质量安全。

1 材料与方法

1.1 样品来源2014年3月至12月间，自山东地区不同生猪屠宰场采集样品，屠宰场A、B、C、D、E分别采集样品182份、261份、192份、180份、185份，共1 000份。标记后，冷藏运至实验室进行分离鉴定并保存。

1.2 参考菌株毒力基因参考菌株mog A、sse L、spv C、spv R、his J、fli C等基因阳性菌株均由农业部畜禽产品质量安全风险评估实验室保存。

1.3 血清型鉴定按照文献［8］中的方法和产品说明书，用沙门菌属O抗原诊断血清鉴定所保存的沙门菌阳性菌株血清型，被A～F多价O血清凝集的菌株，进一步用O型单因子血清作玻片凝集试验进行分型确定。

1.4 毒力基因引物设计参考文献［5，9］发表的沙门菌mog A、sse L、spv C、spv R、his J、fli C毒力基因序列，设计合成6对沙门菌毒力基因扩增引物，见表1。

表1 6对沙门菌毒力基因引物

1.5 毒力基因的检测以188株沙门菌分离株的DNA为模板，利用6对毒力基因引物进行毒力基因检测。反应体系为25μL：Green Mix 12.5μL，去离子水9.5μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5 μL，DNA模板2μL。反应条件：95℃预变性5 min，94℃30 s，Tm退火30 s，72℃30 s，30个循环。

取7μL PCR产物与1μL 10×Glycerol DNA Loading Buffer混匀，产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳成像后，观察并记录结果。

2 结果

2.1 不同屠宰环节沙门菌污染状况生猪屠宰环节较多，猪肉产品更易受到沙门菌污染，不同屠宰环节沙门菌检出率差异较大，分别为3%～50%，见图1。

2.2 血清分型结果利用玻片凝集试验对沙门菌分离株进行血清型鉴定，检出率较高的3种主要血清型分别为S.derby（n=80）、S.typhimurium（n= 56）、S.thompson（n=34），其次为S.agona（n=3）、S. enteritidis（n=1）S.tsevie（n=2）S.lagos（n=1）、S.oritam⁃erin（n=1）、S.lomita（n=2），且有8株沙门菌不能定型。

2.3 毒力基因携带状况沙门菌毒力基因检测结果显示，6种毒力基因均有检出见图2，其中mo⁃g A和his J基因的检出率最高，分别高达76.60%和62.77%，其次为fli C和sse L基因，检出率分别为34.04%和27.66%。两对质粒毒力基因spv C、spv R分离率较低，分别为3.19%、1.06%，见表2。

图1 山东部分地区生猪屠宰环节沙门菌污染状况比较■：不同屠宰环节沙门菌污染率/%

图2 沙门菌分离株毒力基因PCR产物的电泳图M：DNAMarker DL-2 000；1：spv Cgene；2：mog A gene；3：his Jgene；4：sse L gene；5：fliC gene；6：spv R gene

表2 不同屠宰场6种毒力基因检出数

3 讨论

3.1 污染状况分析生猪屠宰环节是沙门菌污染猪肉制品的源头和关键。本研究沙门菌总污染率为18.80%，与李郁［10］研究调查屠宰场沙门菌污染状况接近，高于侯小刚等［11］屠宰场胴体污染率10.71%。生猪屠宰环节中，肛门拭子、脱毛后、剥皮后、劈半前、后胴体表面以及剥皮工具的污染率较高。肛门拭子中分离的沙门菌大多为生猪本身带有或从待宰圈及运输车等感染或污染，携带率较高则可能在屠宰过程中污染其他健康猪只，造成严重的交叉污染。

3.2 血清型分析对所分离沙门菌阳性菌株进行血清学鉴定，共鉴定出9种血清型，以S.Derby、S.Typhimurium、S.Thompson为主，分离率分别为42.5%、29.8%、18.1%。由此可知，山东部分地区生猪屠宰环节沙门菌的优势血清型为S.Derby，与侯小刚等［11］研究的沙门菌优势血清型一致。

3.3 毒力基因携带状况沙门菌致病性主要与沙门菌毒力岛和毒力质粒基因相关［12］。理论上，沙门菌所携带的毒力基因种类越多，其对人类健康存在的潜在威胁越大。本研究中6种毒力基因均有检出，5个生猪屠宰场毒力基因携带状况存在一定差异，尤其两对毒力质粒基因，仅有屠宰场B和C有检出，检出率较低。生猪屠宰场A、B、C、E均有mog A、sse L、his J、fli C 4种毒力基因的检出，且检出率较高。而屠宰场D仅有一种毒力基因的检出，沙门菌潜在的危险性较低。屠宰场A、B、C、D沙门菌携带的毒力基因均以mog A为主，携带率高达91%、83%、100%、71%，与王晶钰等［9］市售鲜鸡蛋中毒力岛基因mog A检出率接近。屠宰场E以his J为主，携带率高达97%，mog A携带率为66%。

分析不同屠宰环节沙门菌毒力基因携带情况，同时含mog A、sse L、his J和fli C基因的菌株共16株，含mog A、sse L和his J基因的共44株，含mog A、his J和fli C基因的共32株，含mog A、sse L和fli C的共有18株，含sse L、his J和fli C共16株，含mog A和his J、mog A和sse L、his J和fli C、mog A和fli C、sse L和his J基因的分别为80株、52株、50株、44株、44株。同时含4种毒力基因的16株沙门菌，2株来自剥皮前胴体表面，4株来自剥皮后胴体表面，2株来自脱毛后胴体表面，4株来自劈半后胴体表面，2株来自剥皮工具，2株来自劈半工具；同时含有mog A和sse L基因的26株沙门菌也均来自以上环节，因而这些环节沙门菌具有较强的致病性，应引起重视并采取措施加以控制。由于其主要从生猪肛门拭子、剥皮前后胴体表面、劈半前后胴体表面以及剥皮工具分离得到，提示在屠宰过程中应注意防止交叉污染，提高屠宰工具的消毒频率，同时应对宰前的生猪进行严格检疫。

［1］余晓龙.四川地区鸭源沙门菌分离与血清型分析及其药敏性与耐药基因相关性研究［D］.雅安：四川农业大学，2012.

［2］黄福标，卢冰霞，刘磊，等.屠宰猪肠道沙门菌的分离鉴定、耐药性分析及致病性试验［J］.中国畜牧兽医，2012，39（01）：172-177.

［3］王军，郑增忍，王晶钰.动物源性食品中沙门菌的风险评估［J］.中国动物检疫，2007，04：23-25.

［4］曹恬雪，蒋文灿，何文成，等.沙门菌毒力因子的研究进展［J］.中国预防兽医学报，2014，04：331-334.

［5］程琼，庞瑞亮，王若晨，等.不同源沙门菌对小鼠致病力的比较与毒力基因检测［J］.中国人兽共患病学报，2013，05：460-465.

［6］郭伟军，崔照琼，李华春.沙门菌毒力岛及其Ⅲ型分泌系统［J］.上海畜牧兽医通讯，2006，05：49-51.

［7］陈冬平，罗薇.沙门菌毒力相关因子研究进展［J］.西南民族大学学报（自然科学版），2012，05：770-775.

［8］食品安全国家标准.GB4789.4-2010《食品卫生微生物学检验沙门菌检验》［S］.北京:中国标准出版社，2010.

［9］王晶钰，董睿，王利勤，等.市售鲜鸡蛋中沙门菌的分离鉴定及毒力岛基因检测［J］.食品科学，2012，16：154-158.

［10］李郁，焦新安，魏建忠，等.屠宰生猪沙门菌分离株的血清型和药物感受性分析［J］.中国人兽共患病学报，2008，24（1）：67-70.

［11］侯小刚，刘书亮，韩新锋，等.四川部分地区猪肉产业链中沙门菌的分离及其鉴定［J］.食品科学，2013，34（11）：250-253.

［12］王德宁.鸡源沙门菌耐药性、致病性与毒力基因相关性分析［D］.哈尔滨：东北农业大学，2014.

Analysis of virulence genes of Salm onella isolated from pig slaughtering process in Shandong province

LIU Xian-xian1，2，WANG Juan2，ZHANGQian3，ZHAO Jian-mei2，QU Zhi-na2，WANG Yu-dong2，SUN Jia-yi1，HUANG Xiu-mei2，ZOUMing1，WANG Jun-wei2
（1.Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；2.Laboratory of Safety for Animal Products，China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266032，China；3.Huangdao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao 266555，China）

To understand the virulence gene carriage condition of Salmonella during pig slaughtering in Shandong Province，and provide basic data for further the risk assessment of Salmonella.Collected 1000 samples from 5 different size pig slaughter⁃house links，and then isolated Salmonella，and detected mogA，sseL，spvC，spvR，hisJ，fliC virulence genes using PCR.188 Salmo⁃nella strainswere isolated.The isolated ratewas 18.8%.our results showed that9 serotypeswere identified，and theyweremainly S. derby，S.typhimurium，and S.thompson.Six virulence geneswere analyzed and the detection rate ofmogA was 76.70%and the de⁃tection rate of hisJwas 62.77%.However，the detection rate of spvR and spvC were low，only 3.19%and 1.06%，respectively.The Salmonella strains containingmultiple virulence geneswere rare.There was big difference in virulence gene carriage in the slaugh⁃terhouse of different areas.Salmonella in links of pig slaughtering in Shandong area were carrying different degrees of virulence genes，and Salmonella contamination was severe.Therefore，good manufacturing practices need to be implemented，and measures are required to reduce salmonella contamination duing pig slaughter to reduce the occurrence of food poisoning.

pig；slaughtering；Salmonella；virulence gene

s：WANG Jun-wei；ZOUMing

S852.65+1

A

0529-6005（2015）12-0083-03

2015-05-21

国家农产品质量安全风险评估专项（2015）（GJFP-201500803）

刘鲜鲜（1990-），女，硕士生，研究方向为兽医药理学，E-mail：312749043@qq.com

王君玮，E-mail：yffs2000@sina.com；邹明，E-mail：zoudnet@163.com