实时荧光定量RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒方法的建立及应用

方振华，丁 利

（1.海南职业技术学院生物工程学院，海南海口570216；2.海南师范大学生命科学学院，海南海口571158）

实时荧光定量RT-PCR检测猪传染性胃肠炎病毒方法的建立及应用

方振华1，丁 利2

（1.海南职业技术学院生物工程学院，海南海口570216；2.海南师范大学生命科学学院，海南海口571158）

本研究将猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）N基因部分片段克隆并连接到pGEM-T Easy载体上，得到重组质粒，以此为标准模板进行SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR扩增并制作标准曲线，建立TGEV的荧光定量RT-PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL，具有良好的特异性和重复性；对20份临床疑似病料进行检测，发现14份为荧光定量RT-PCR阳性，而常规RT-PCR只能检测出10份。结果表明，建立的实时荧光定量RT-PCR方法具有特异、敏感、快速、重复性好等优点，可用于临床TGEV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。

猪传染性胃肠炎病毒；实时荧光定量RT-PCR；SYBRGreen I

猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis of swine，TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的一种高度接触性传染病，以呕吐、严重腹泻、脱水以及致两周龄内仔猪高死亡率为主要临床特征，是我国法定重点防控的疫病之一。随着中国集约化养猪产业的程度愈来愈高，TGE的发生与流行有明显加重的趋势，且与其他病原混合感染和继发感染已成为当今猪群发病的普遍规律，导致临床诊断难度大大增加，因此研究特异灵敏的诊断方法对快速检测及防治TGE具有十分重要的意义。目前，常规检测TGEV的方法大部分操作繁琐，且灵敏度不高［1-2］，而实时荧光定量PCR技术具有灵敏度高、特异性强、操作简便快捷等特点，且可以有效防止检测过程中的污染及假阳性，可大大提高检测效率［3］。本研究以TGEV N基因序列为靶基因，建立一种特异的实时定量PCR方法，用于TGEV的实时检测，该法快速、灵敏、准确，从而为TGEV的早期快速诊断提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 毒株、菌株猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒三联苗，购自中国兽药监察所；猪传染性胃肠炎病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、PK-15细胞、大肠杆菌DH5α均由本实验室保存；TGEV临床检测病料来自各地市自然感染猪。

1.2 主要试剂T载体、Taq DNA聚合酶、dNTP等均为Fermentas公司产品；DNA凝胶快速回收试剂盒、质粒提取试剂盒为Vigorous公司产品；反转录试剂盒，购自北京全式金生物科技有限公司；2× SYBRGreen-IMasterMix为宝生物工程（大连）有限公司产品，其他常规试剂均由本实验室提供。

1.3 引物设计与合成根据Gen Bank公布的TGEV N基因序列，设计N基因引物，由南京金斯瑞生物技术有限责任公司合成。序列为上游引物：5′-ACAAACACACCTGGAAGAGAACT-3′；下游引物：5′-GAATGCTAGACACAGATGGAACAC-3′，预计扩增片段165 bp。

1.4 质粒标准模板的制备病毒总RNA提取按TRIZol试剂说明书进行。反转后的cDNA用于目的基因片段的扩增，然后将目的片段与pGEM-T Easy载体连接，转化DH5α感受态细胞，并对重组质粒进行PCR鉴定，将鉴定正确的重组质粒进行测序验证。经验证阳性的重组质粒，测定质粒模板浓度，计算标准品的拷贝数，然后将其10倍倍比稀释作为实时荧光定量PCR阳性标准模板。

1.5 实时荧光定量PCR扩增用标准品作为模板，进行SYBRGreenⅠ荧光定量PCR扩增。分别对反应体系中的引物浓度、退火温度等条件进行优化，通过预试验对反应条件进行优化，最终确定最佳反应体系和反应条件。

1.6 实时荧光定量PCR标准曲线的制备以10倍梯度稀释的质粒为模板进行荧光定量PCR扩增，并利用Bio-Rad iQ5软件进行分析，得到扩增曲线、溶解曲线和标准曲线。

1.7 特异性、重复性和敏感性试验将猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒样品的cDNA或DNA，按照优化的条件进行荧光定量PCR，验证其特异性、重复性和敏感性。

1.8 临床样品的检测对各地市送检的20份临床病料进行处理，提取RNA，应用普通RT-PCR方法和荧光定量PCR方法检测。

2 结果

2.1 普通PCR结果与测序分析以TGEV N基因设计引物进行普通RT-PCR扩增，PCR产物经电泳鉴定，与预期结果一致。将目的片段回收、纯化、克隆到pGEM-TEasy载体（简称pGEM-T-N），质粒PCR产物测序结果进行BLAST比对，结果与TGEV相应区域100%同源。

2.2 实时荧光定量PCR条件的优化对TGEV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增条件进行优化，最终确定如下：反应总体系为25μL，2×SYBRGreen-IMaster Mix 12.5μL，上、下游引物各0.5μL（20μmo l/L），模板1μL，灭菌去离子水10.5μL。循环条件为：95℃预变性10min；95℃5 s，60℃30 s。40个循环数，在该条件下扩增曲线起跳早，荧光值较高，溶解曲线峰狭窄单一。

2.3 标准曲线的绘制将标准样品10倍倍比稀释，并分别以此为模板进行荧光定量PCR扩增。从图1可知，在溶解曲线上有单一的峰，说明本方法特异性高。经IQ5荧光定量PCR仪软件绘制质粒标准模板的标准曲线（图2），由结果可知斜率为R2=0.998，扩增效率为100.2%。说明在稀释的范围内线性关系良好。

图1 TGEV荧光定量RT-PCR溶解曲线

图2 TGEV荧光定量RT-PCR标准曲线

2.4 荧光定量PCR的特异性、重复性和敏感性试验将TGEV、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒的模板进行荧光定量PCR检测，结果发现除TGEV能够扩增出S型曲线外，其他对照病毒均不能检测出S型曲线，表明所建立的方法具有较强的特异性（图3）。选取同一稀释倍数的重组质粒为模板，进行荧光定量PCR检测。由图4可知，同一浓度所得的Ct值基本相同，变异很小，表明此方法的重复性良好。将模板质粒稀释成浓度为101，102，103，104，105，106，107，108，109的标准品，并分别以此为模板进行荧光定量PCR扩增，由扩增曲线可知其灵敏度为10拷贝/μL（图5）。

图3 TGEV荧光定量RT-PCR特异性试验

图4 TGEV荧光定量RT-PCR重复性试验

图5 TGEV荧光定量RT-PCR敏感性试验

2.5 临床样品检测结果比较对20份临床病料应用所建立的荧光定量RT-PCR方法和普通RTPCR方法同时检测，设置阳性病料2份和阴性病料2份作为对照。结果显示，用常规RT-PCR检出10份TGEV阳性病料，而荧光定量PCR检出14份阳性病料，荧光定量PCR检测灵敏度高于常规RT-PCR。

3 讨论

实时荧光定量PCR是一种新型的核酸定量技术，由于其灵敏度高、重复性好、污染少等优点，被广泛应用于医学检测、基因表达研究、病原体检测、病毒荷载量测定等方面［6］。常用的PCR定量方法主要包括SYBRGreen I染料法、Taq Man探针法、分子信标法、杂交探针法等［4］。SYBR Green I荧光定量PCR方法只需在SYBR Green I反应混合液中加入引物和待测样品，其成本相对低廉。与Taq Man探针法相比，更加简便，无需合成价格昂贵的探针［5］。该技术应用于TGEV检测，能在病毒隐性感染和猪发病早期进行快速确诊和实时监测。部分学者利用TGEV基因序列设计合成引物和探针，建立了Taq Man荧光定量RT-PCR方法，其检测敏感性比常规RT-PCR方法提高了多倍［6-7］。张云、王建中等研究者针对TGEV的S基因等建立了SYBRGreen I荧光定量RT-PCR检测方法，敏感性高、特异性强、稳定性好［8-10］。本试验建立的TGEV荧光定量RT-PCR检测方法灵敏度可达10拷贝/μL，与猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪乙型脑炎病病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒不发生交叉反应，具有重复性好、特异性强、灵敏度高等优点。与普通RT-PCR相比，SYBRGreen IPCR的扩增和检测都在同一管内完成，不需要后续的电泳检测，有效解决了污染问题，而且操作更简便，检测时间更短，可作为规模化猪场TGEV的净化检测方法，同时也可用于临床TGEV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。

［1］李小兰，聂福平，李应国，等.猪传染性胃肠炎病毒NASBA检测方法的建立［J］.中国预防兽医学报，2010，32（6）：451-454.

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［5］刘歆，徐根明，郭江峰，等.基于SYBRGreenⅠ的双链DNA定量方法［J］.中国生物工程杂志，2008，28（1）：55-60.

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Development of real-time RT-PCR for detecting transm issible gastroenteritisvirus and its prelim inary application

FANG Zhen-hua1，DING Li2
（1.School of Biological Engineering，Hainan College of Vocation and Technique，Haikou 570216，China；2.College of Life Sciences，Hainan Normal University，Haikou 571158，China）

Transmissible gastroenteritis virus（TGEV）N genewas cloned into pGEM-TEasy vector，which is used as the standard template for real-time RT-PCR.Then，the standard curvewasmade，and the real-time RT-PCRmethod was established for TGEV detection.The sensitivity of themethod could reach 10 copies/μLwith good specificity and repeatability.20 samples from sick pigswere tested，ofwhich 14 were positive by real-time RT-PCR detection，while only 10 were tested positive by conventional RT-PCR.These results showed that the real-time RT-PCRmethod was specific，sensitive，rapid and good repeatability.Thus，Thismethod established RT-PCR can be used for the early diagnosis of TGEV infection andmolecular epidemiological investigation.

transmissible gastroenteritis virus；real-time RT-PCR；SYBR GreenⅠ

DING Li

S852.65+1

A

0529-6005（2015）12-0020-03

2014-07-14

国家自然科学基金（31502036）；海南省自然科学基金（314076；20153086）

方振华（1980-），男，讲师，硕士，从事动物饲养管理及疾病防治教学和科研工作，E-mail：okay1688@163.com

丁利，E-mail：dingli705@163.com