鱼腥草挥发油抗淋巴瘤细胞谱效关系*

张壮丽，赵 宁，赵志鸿，张小俊，王桂芳

1)河南省医药科学研究院药化室 郑州 450052 2)郑州大学药学院 郑州 450001

鱼腥草挥发油抗淋巴瘤细胞谱效关系*

张壮丽1)△，赵 宁2)，赵志鸿1)，张小俊1)，王桂芳1)

1)河南省医药科学研究院药化室 郑州 450052 2)郑州大学药学院 郑州 450001

△女，1978年1月生，博士，助理研究员，研究方向：中药新药，E-mail：zzl7814@163.com

鱼腥草挥发油；GC-MS；谱效关系；淋巴瘤

目的：以鱼腥草挥发油GC-MS特征谱峰面积和其对Raji细胞的抑制率为基础进行谱效关系分析，以确定鱼腥草挥发油抗肿瘤的药效成分组。方法：通过GC-MS技术获取不同产地鱼腥草挥发油的色谱图，通过MTT实验考察不同产地鱼腥草挥发油对Raji细胞的抑制率，采用偏最小二乘回归分析技术对色谱峰与抑制率的内在联系进行谱效分析。结果：GC-MS特征谱中色谱峰6、14、15、22、25、26、27和细胞抑制率具有较强的正相关关系，其代表物质对抗肿瘤药效贡献较大，为抗肿瘤药效成分组。结论：鱼腥草挥发油的抗肿瘤作用是多种成分共同作用的结果。

鱼腥草为三白草科蕺菜属植物蕺菜全草，具有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋的功效。鱼腥草挥发油是该药材的主要活性成分[1]，具有抗病毒、抗菌、抗炎、镇咳、祛痰、抗过敏、利尿、增强机体免疫功能、抗肿瘤等药理作用[2-9]。目前鱼腥草挥发油的质量鉴定主要以化学成分为指标，与药效脱节。该实验采用偏最小二乘回归分析(PLS)对13个产地的鱼腥草挥发油气相色谱-质谱(GC-MS)特征谱与挥发油对Raji细胞抑制率的内在联系进行谱效分析，建立特征峰面积对肿瘤细胞抑制率的回归方程，以期找到鱼腥草挥发油抗肿瘤的主要药效成分。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药材 鱼腥草样品分别采收自四川、重庆和云南等主产地，其中四川、重庆地区7个产地：四川大邑县出江镇(编号1)，四川崇州三江镇王桥村(编号2)，四川犍为县(编号7)，四川雅安市(编号8)，重庆市(编号9)，四川巴中市平昌县笔山镇狮岭村(编号10)，四川成都荷花池药材市场(编号11)；云南省6个产地：云南西双版纳勐海县南糯山(编号3)，云南保山市施甸县旧城乡(编号4)，云南保山市施甸县仁和乡(编号5)，云南保山市龙陵县平达乡(编号6)，云南玉溪市峨山县小街镇(编号12)，云南红河州石屏县异龙镇(编号13)。

1.1.2 试剂和细胞株 正己烷(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，无水硫酸钠(分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司)，重蒸水、RPMI 1640培养基、DMSO(北京索莱宝生物医药科技有限公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，MTT(美国Sigma公司)。Raji细胞株(河南省医药科学研究院药化室保存和自行传代培养)。

1.1.3 仪器 7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪、Hp-5 MS毛细管色谱柱(美国安捷伦公司)，电子天平、生物安全柜、台式高速冷冻离心机(香港力康发展有限公司)，显微镜[舜宇光学科技(集团)有限公司]，超净工作台[净化设备(苏州)公司]，高压灭菌锅(日本Hirayama公司)，CO2培养箱[施都凯仪器设备(上海)有限公司]，气浴恒温振荡器(江苏金坛市中大仪器厂)，酶标仪(美国Bio-Rad公司)，96孔板、50 mL细胞培养瓶(美国Corning公司)。

1.2 鱼腥草挥发油的制备 将干燥鱼腥草药材粉碎后，称取100 g，装入2 000 mL圆底烧瓶中，加蒸馏水，混匀并浸泡一定时间后提取挥发油[10]。收集所得浅黄色挥发油，精密称量，计算挥发油提取率，封装、冻存备用。

1.3 不同产地鱼腥草挥发油GC-MS特征谱的绘制

1.3.1 样品溶液的配制 精密量取挥发油7.5 μL，加1.5 mL正己烷，并用无水硫酸钠除水，5 000 r/min离心10 min，抽取上清液即得体积分数0.5%的样品溶液。

MS条件：接口温度280 ℃，电离方式为EI电离，电离能量70 eV，离子源温度230 ℃，MS四级杆温度150 ℃，溶剂延迟3 min，扫描质量范围:质荷比 20～500 amu。

1.4 鱼腥草挥发油对肿瘤细胞的抑制实验 将制备好的13个产地的鱼腥草挥发油加DMSO溶解，分别配制成体积分数0.100 0%、0.020 0%、0.004 0%、0.001 3%的样品溶液。取96孔板，设置给药组和空白组，将Raji单细胞悬液接种于96孔板，103～104个/孔，给药组分别加入不同剂量挥发油溶液，空白组加等体积的空白培养液，加样后总液量为100 μL/孔。将加完样的96孔板置培养箱中于37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养72 h。然后每孔加5 g/L的MTT 20 μL，在相同条件下继续培养4 h，取出后离心，小心弃去上清液，每孔加150 μL DMSO并将培养板置于微孔板振荡器上振荡10 min，使结晶物充分溶解。用酶标仪在570 nm波长处测量各孔吸光度(A) 值，并计算细胞抑制率：抑制率=(1-给药孔A值/空白孔A值)×100%。实验重复3次。

1.5 PLS法分析谱效关系 以体积分数0.001 3%挥发油对肿瘤细胞的抑制率为因变量(Y)，以29个考察峰峰面积为自变量(X)，进行谱效关系分析。

2 结果

2.1 方法学考察

2.1.1 出峰情况考察 结果见图1。所有成分均能在1 h内出峰，且基本达到基线分离。

图1 鱼腥草挥发油GC-MS记录图

2.1.2 稳定性考察 相对保留时间比值(RRT)和峰面积比值(RPA)的RSD值分别小于0.02%和2.57%，表明样品溶液在24 h内性质稳定。

2.1.3 精密度考察 RRT和RPA的RSD值分别小于0.10%和2.61%，表明仪器的精密度良好。

2.1.4 重复性考察 RRT和RPA的RSD值分别小于0.12%和2.63%，表明该方法的重复性较好。

2.2 谱图分析 13个产地鱼腥草挥发油的GC-MS色谱图见图2。特征峰鉴定结果见表1，经谱库检索并参考文献[11]，推测25号峰簇可能为表中所列几个化合物的组合。

2.3 鱼腥草挥发油对Raji细胞的抑制率 结果见表2。由表2可知，鱼腥草挥发油对Raji细胞具有很好的抑制效果，挥发油剂量为体积分数0.001 3%时多数产地的鱼腥草挥发油仍能达到50%左右的抑制率。

2.4 PLS法分析谱效关系 结果显示回归方程为：Y=1.003×10-13-0.261X1-0.281X2-0.018X3-0.165X4-0.226X5+0.192X6-0.201X7-0.030X8-0.273X9+0.036X10-0.114X11+0.058X12-0.063X13+0.099X14+0.201X15+0.025X16-0.142X17-0.040X18+0.039X19-0.065X20-0.076X21+0.281X22-0.353X23-0.037X24+0.393X25+0.137X26+0.101X27-0.160X28-0.076X29。可见，29个自变量的回归系数有正、有负。其中X6、X14、X15、X22、X25、X26、X27和细胞抑制率具有较强的正相关关系，特征峰成分鉴定为对伞花烃、(-)-4-萜品醇、2,4,6-三甲基苯甲醇、甲基正壬酮、十一醇、正癸酸、乙酸香叶酯、2-十二烷酮和石竹烯。

图2 13个产地鱼腥草挥发油GC-MS特征谱

峰号t(保留)/min化合物峰号t(保留)/min化合物14.853α-蒎烯1613.034α-萜品醇25.274莰烯1713.584正癸醛35.971β-水芹烯1814.493正壬醇46.083β-蒎烯1915.522芳樟醇56.460β-月桂烯2016.265环辛烷67.541对伞花烃2116.833左旋乙酸冰片酯77.674D-柠檬烯2217.241甲基正壬酮88.648γ-萜品烯2318.002α-环香叶醇醋酸酯99.609萜品油烯2418.596癸酸甲酯1010.013紫苏烯2520.851～21.582十一醇、正癸酸、乙酸香叶酯1110.130壬醛2621.9422-十二烷酮1212.135L-龙脑2723.003石竹烯1312.328正壬醇2827.8502-十三烷酮1412.544(-)-4-萜品醇2933.105氧化石竹烯1512.8282,4,6-三甲基苯甲醇

表2 鱼腥草挥发油对Raji细胞的抑制率(n=3) %

3 讨论

分析方法和数据处理技术是谱效关系研究的关键[12]。该实验样本数为13(产地)，远少于自变量数(特征峰)，且中药特征谱在建立谱效关系模型时色谱峰之间可能存在多重共线性，不适用普通多元线性回归分析。PLS对于处理这类样本量小、自变量多且变量间存在多重相关性问题的数据样本具有独特优势，并可同时实现回归建模、数据结构简化以及2组变量间的相关分析，在最终模型中将包含原有的所有自变量，从而最大限度地利用数据信息[13]。

该实验采用PLS方法对13个产地的鱼腥草挥发油GC-MS特征峰峰面积与鱼腥草挥发油对Raji细胞抑制率之间进行谱效关系分析。结果表明，特征峰6、14、15、22、25、26、27和细胞抑制率具有较强的正相关关系。由此可得出结论：鱼腥草挥发油的抗淋巴瘤药效物质组包括对伞花烃、(-)-4-萜品醇、2,4,6-三甲基苯甲醇、甲基正壬酮、十一醇、正癸酸、乙酸香叶酯、2-十二烷酮和石竹烯，其对Raji细胞的抑制作用应为这些物质协同作用的结果。

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(2014-09-09 收稿 责任编辑姜春霞)

Spectrum-effect relationship of GC-MS spectrum of volatile oil from Houttuynia cordata Thunb with antilymphoma effect

ZHANGZhuangli1)，ZHAONing2)，ZHAOZhihong1)，ZHANGXiaojun1)，WANGGuifang1)

1)MedicalChemistrySection,HenanAcademyofMedicalandPharmaceuticalSciences,Zhengzhou450052 2)CollegeofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

volatile oil from Houttuynia cordata Thunb; GC-MS; spectrum-effect relationship; lymphoma

Aim: To study the spectrum-effect relationship on the basis of GC-MS chromatogram and data of the inhibition rate on Raji cells, in order to definite the anti-tumor active ingredient of volatile oil from Houttuynia cordata Thunb. Methods: The inherent connections were studied between GC-MS chromatogram and inhibition rate with partial least squares regression analysis. Results: There were 7 peaks such asX6,X14,X15,X22,X25,X26,X27 of the GC-MS chromatogram played the most important role in the anti-tumor effect, with high positive relationship, and were determined as effective compounds. Conclusion: The anti-tumor effect of volatile oil from Houttuynia cordata Thunb is the result of combined effect of several components.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.018

*河南省省属科研单位社会公益项目预研专项 2013,2014；河南省重点科技攻关计划项目 142102310433

R285.5