人脐带间充质干细胞的体外培养及其对大鼠血液指标的影响

韩晓燕 汪伟民

·基础研究·

人脐带间充质干细胞的体外培养及其对大鼠血液指标的影响

韩晓燕 汪伟民

目的 研究人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的体外培养以及其不同浓度对大鼠血液指标的作用。 方法 体外培养hUC-MSCs，将SPF级SD雌性大鼠45只,平均体质量为(200±10)g,随机均分为5组：低、中、高浓度细胞移植组，生理盐水组，空白对照组，其中，低浓度为(0.5×106/mL)、中浓度为(1×106/mL)、高浓度为(2×106/mL)、生理盐水组(0.9 % NS)。将培养成功的hUC-MSCs配比成相应的浓度，各取1 mL经过大鼠尾静脉输注到大鼠体循环内，空白对照组不做任何处理；分别按注射后1 d，5 d，10 d时间顺序，每次分别随机抽取5组中1个亚组的大鼠处死以收集腹主动脉内血液，检测其血常规及生化指标并进行数据分析，了解hUC-MSCs对大鼠血常规、生化指标是否存在影响。 结果 本实验通过收集胎儿脐带成功在体外培养出hUC-MSCs。另将不同浓度的hUC-MSC经大鼠尾静脉输注大鼠体循环内，血液数值上得到：① 大鼠白细胞随hUC-MSCs浓度的升高而升高，且各组之间差异有统计学意义(P<0.05)，其数值随时间的改变没有降低；② 大鼠总胆红素在1 d后出现增高，低浓度组表现显著，随时间推移恢复正常。 结论 hUC-MSCs可在体外成功分离培养；经大鼠尾静脉输注大鼠体循环内，可引起白细胞的升高和总胆红素的一过性升高。

人脐带间充质干细胞； 体外培养； 尾静脉注射； 大鼠

众多骨髓间充质干细胞研究结果表明，因其取材方便，易于分离培养，扩增迅速，多向分化潜能以及具有向损伤处迁移的众多优势而日益受到人们的关注[1]，逐步从动物实验的应用转向临床。研究人员努力实践其应用于临床的可行性，其中包括多能分化潜力、免疫原性、修复能力等[2]，并涉入到造血功能重建、心脏系统疾病、免疫风湿改善等各类学科[3-5]。近年来，科研进一步发现人类脐带中的间充质干细胞增殖数量远多于骨髓及外周血[6]，从中分离出人脐带血间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)更简易，含量更多[7-9]，并有报道[10，11]，骨髓MSCs随着年龄的增长数量将明显减少，为追求更适宜的间充质干细胞来源，人们将重点转移至hUC-MSCs。本文着重探讨人脐带间充质干细胞的体外培养及对大鼠的血液指标的影响，并观察注射后大鼠有无严重的排斥反应。

1 材料与方法

1.1 材料 ①人脐带间充质干细胞：在无菌条件下取足月剖宫产的健康胎儿脐带组织；②实验动物：健康SPF级SD雌性大鼠45只，6周龄，体质量(200±10)g，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。③实验试剂：α-MEM培养基(美国Gibco)；水合氯醛(深圳三利化学制品有限公司)；苦味酸(武汉福德化工有限公司)。④实验仪器及设备：DK-8D型电热恒温水槽(上海跃进医疗器械厂)； SW-CJ-1ED型净化工作台(苏州净化设备有限公司)；BH75-HERA cell 150培养箱(克勒格瓦尼(上海)分析仪器有限公司)；IX70显微镜(奥林巴斯)；台式离心机 LDZ5-2(康源科技)；全自动生化分析仪RL7600D(瑞士罗氏公司)；血常规分析仪SYMEX XE-2100(日本东亚公司)。

1.2 方法

1.2.1 hUC-MSCs的体外培养及扩增 本实验hUC-MSCs体外培养的原理是干细胞对培养瓶的较强贴壁能力。在无菌条件下取足月剖宫产的健康胎儿脐带组织，2 h内用含200 U/mL青、链霉素的磷酸缓冲液(PBS PH=7.4)反复冲洗去除表面的血液成分，用无菌剪刀剔除脐动、静脉后主要是取脐带的华尔通胶-又称脐带基质，在含少量PBS下将脐带组织切割成体积约1 mm×1 mm×1 mm 的组织块，随后放入无菌试管中加1% 胶原酶Ⅱ 37℃消化2 h，中间间断震荡混匀，再加入2.5% 胰酶 3～5 mL继续消化30 min后加入血清3～5 mL终止，用200目过滤网过滤，去除未消化的组织。将过滤液用PBS稀释，使用台式离心机以2 500 r/min离心20 min。弃除上层液体，将底层沉淀物再次稀释，继续以2 000 r/min离心20 min，收集离心沉淀细胞，细胞板进行计数。将分离的细胞调整密度为5×105/cm2接种于T25的培养瓶中。接种前在培养瓶中加入α-MEM培养基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、2 mmol/L谷胺酰胺、5 ng/mL EGF)。置于含有5%～6% CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养。1～1.5 h后取出，可见组织细胞已经粘附在培养皿底部，沿边缘缓慢加入DMEM/F12+FBS (不能冲起贴壁组织)，让培养基缓慢蔓延整个培养体系。48～72 h后细胞换液，去除非贴壁细胞，以后每3天换液1次，换液过程中避免冲击贴壁细胞，倒置显微镜下观察细胞贴壁及克隆形成情况，细胞融合80%～90%后使用2.5%胰酶在37℃下消化1～2 min镜下观察hUC-MSCs由长梭形转变为圆形并从培养瓶底漂浮起来后，加入所用胰酶量的4～5倍(4～5 mL EME培养基)进行终止胰酶对hUC-MSCs的消化, 用无菌移液管将从培养瓶底部消化下来的hUC-MSCs混悬液移至15 mL的离心管中，在1 200 rpm下离心5 min后可见管底少许白色细胞层(即hUC-MSCs), 用无菌移液管移弃上层离心液体并留取白色细胞层，再加入12 mL EME培养基缓慢吹打均匀，以1 ∶2或1 ∶3平均分装在培养瓶中，镜下观察后再将其放至在37℃，5%～6% CO2培养箱中培养。待细胞总数达到31.5×106时，调整好hUC-MSCs浓度，配成低、中、高3个不同浓度组：低剂量(0.5×106/mL)实验组、中剂量(1×106/mL)实验组、高剂量(2×106/mL)实验组。

1.2.2 实验分组 按随机分配原则，将45只SD大鼠分为空白对照组(K1)，生理盐水组(K2)，低、中、高浓度3组(S1、S2、S3)各9只。随后再将各组随机分为3个亚组(K11、K12、K13；K21、K22、K23；S11、S12、S13；S21、S22、S23；S31、S32、S33)，每个亚组3只。在不同浓度组的hUC-MSCs中各抽取1 mL hUC-MSCs，经大鼠尾静脉分别注射各实验组，同时生理盐水组将1 mL的0.9% NS经尾静脉注射，注射后用碘伏消毒输注部位，以防局部感染。空白对照组不进行任何注射。将每组大鼠分别用苦味酸在身体不同的部位做标记(低浓度组为右前肢，中浓度组为右后肢，高浓度组为左后肢)，再将大鼠放入鼠笼中，注意保暖、大鼠的饲料(以每只30 g/d供应，水随意供应)，每天观察。

1.2.3 标本采集及检测 按注射后按1 d，5 d，10 d时间顺序每次分别随机抽取5组中1个亚组，将大鼠处死后收集腹主动脉内血液10 mL分别放入相应试管内(血常规管、生化管)。具体操作步骤如下：①准备好2把无菌镊子、2把止血钳、1把手术刀。10%水合氯醛，以及送检所需的血常规、生化试管。②用10%水合氯醛注入大鼠腹腔内将大鼠麻醉(水合氯醛的用量为大鼠体质量的0.3%)。③用棉线将大鼠的头部和四肢固定在动物台上，用手术刀将大鼠的腹部皮肤打开，再用组织钳将腹部肌肉逐步打开，直至暴露出腹主动脉和腹主静脉。④找出腹主动脉后抽取血液，将所需检查的试管装至所需量后立即送往实验室检查血液生理指标，得出结果。总共分3次将大鼠全部处理完毕。

2 结果

2.1 hUC-MSCs体外培养 首次换液前培养瓶内有大量悬浮细胞，主要为圆形红细胞(见图1a)。首次换液后，可见部分细胞已贴壁，胞体呈圆形或多边形，漂浮的不贴壁细胞大部分随换液除去；培养3 d，贴壁细胞胞体明显增大并开始分裂增殖，细胞形态渐变为梭形或纺锤形，呈成纤维细胞样生长，形成大小不一的集落。7天时，细胞变成长梭形，基本形成明显克隆，细胞分裂增殖明显，胞浆丰富，核大，呈椭圆形。在10～14天，培养的细胞长满培养瓶底的80%～90%并融合，呈漩涡状或辐射状排列，细胞变得扁平，胞体狭长，核呈椭圆形。分瓶传代培养的细胞初始呈圆形，2～4 h贴壁伸展，大多数细胞呈梭形的成纤维细胞样形态，均匀性分布生长，细胞增多汇合呈漩涡状或辐射状排列，少数细胞为三角形、多角形，胞核呈圆形或椭圆形。传代培养的BMSC在形态学上更加趋于一致，为成纤维细胞样(见图1b)。

2.2 大鼠血液指标分析

2.2.1 大鼠白细胞数据分析 hUC-MSCs经大鼠尾静脉输注至体循环内后，在不同浓度组不同时间点采集大鼠腹主动脉血进行WBC、RBC、PLT、ALT、AST、TBIL、LDH、CPK、BUN测定；将其血液指标采用one-way anova进行数据分析。低、中、高3个浓度实验组之间的WBC数值差异有统计学意义(P<0.05),且分别与自生理盐水组、正常对照组的WBC数值比较，差异有统计学意义(P<0.05)。白细胞数值随浓度增高而增多，随时间的推移并未减少。见图2。

2.2.2 大鼠直接胆红素数据 低浓度组较其他各浓度组有明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)，且随时间推移而逐步恢复正常。见图3。

3 讨论

近年来，间充质干细胞在治疗细胞、脏器损伤性疾病和器官修复等方面成为研究热点，这也为临床治疗提供有利的基础。而临床应用中最常见的突出问题即是免疫排斥和致瘤性。研究[12-16]表明，间充质干细胞仅低表达MCH-Ⅰ而不表达MCH-Ⅱ，并缺乏共刺激分子CD80，CD86和CD40[12]，不能诱导异体或异种淋巴细胞增殖，进而阻断了抗原识别，抗原呈递等一系列免疫应答，减轻排斥反应增加移植成功率，并降低了移植物抗宿主疾病的发生，同时该细胞无致瘤性。故本实验利用hUC-MSCs对鼠类进行异种移植,且采用大鼠尾静脉输注。经过输注不同浓度hUC-MSCs，在不同时间点观察相关血液指标，得出：hUC-MSCs可引起大鼠白细胞增高。考虑一方面该实验是异种移植，可能由于种族之间存在炎性应激保护自身机体而引起[17]；另一方面大量文献[18-24]提示干细胞参与机体免疫应答，白细胞的增多可能是干细胞免疫答应过程的表现，同时虽出现大鼠胆红素增高，但是根据统计分析，增高为一过性可自行恢复正常，对肝脏其他功能指标并未引起异常。通过该结果也间接证实hUC-MSCs在肝脏内发挥作用，且在体循环中存活。实验过程中大鼠在接受静脉注射后，饮食、活动及生命体征均保持正常，未出现腹泻、抽搐、死亡等现象，其操作性得到肯定，安全性有待进一步验证。本实验经过不同的时间点所测得的数据，得出：hUC-MSCs可引起大鼠体内白细胞的升高和直接胆红素的一过性升高；其他血液指标未见明显差异性改变(P>0.05)。另在细胞体外培养传代的实验过程中发现：① hUC-MSCs在37℃，6%的CO2浓度的培养箱中较37℃，5.5%的CO2浓度的培养中生长更加旺盛,CO2的浓度是否对间充质干细胞的培养有一定的作用，还需要实验进一步验证；② 直接使用2.5%胰酶进行消化贴壁细胞时镜下观察，可见hUC-MSCs迅速由梭形变成圆形，即使立即终止消化仍会出现细胞生长延迟或不增；随后传代时改用2.5%胰酶加配等量PBS液进行稀释，细胞生长分裂速度明显改善。考虑可能是原浓度胰酶对细胞消化过快，不易掌控终止时间，同时浓度高对干细胞损伤较大，影响细胞贴壁分裂生长。③ 镜下观察间充质干细胞会大量聚集在培养瓶的两面交汇处(分装的每瓶都出现此类现象)，究竟是何原因，有待今后实验继续探讨。

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(2015-03-24修稿 2015-06-20修回)

安徽省教育厅自然科学基金资助项目(项目编号：KJ2009A118)

230022 合肥 安徽医科大学第一附属医院干部呼吸内科

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.08.001