miR-21反义寡核苷酸增强地西他滨体外抗白血病效应*

王晔恺， 于 倩， 林奇龙， 姚燕珍， 梅佩玉， 李翊卫

(舟山医院检验中心， 浙江 舟山 316004)



miR-21反义寡核苷酸增强地西他滨体外抗白血病效应*

王晔恺， 于 倩， 林奇龙， 姚燕珍， 梅佩玉， 李翊卫△

(舟山医院检验中心， 浙江 舟山 316004)

目的： 研究miR-21反义寡核苷酸(anti-miR-21 oligonucleotide， AMO)对地西他滨(decitabine,DCA)抗白血病效应的影响及可能机制。方法: 将AMO和无义寡核苷酸(scramble oligonucleotide, SCR)通过脂质体转染导入HL-60细胞，实时荧光定量PCR(real-time PCR)验证转染效率，再分别与DCA 0.5、2.0和4.0 μmol/L作用48 h。Real-time PCR分别检测人周期节律蛋白3(hPer3) mRNA表达，Annexin V/PI法检测凋亡，流式细胞术检测CD117和CD11b 平均荧光强度(MFI)。结果: AMO转染组miR-21表达(0.35±0.07)低于空白组(0.71±0.07)和SCR转染组(0.66±0.05)，差异有统计学意义(P<0.05)。AMO转染组的HL-60细胞DCA的IC50低于空白组和SCR转染组(P<0.01)。同一浓度下，AMO组的早期凋亡率、CD11b的MFI和hPer3 mRNA均高于同一浓度药物作用的空白组和SCR组，CD117 MFI均低于同一浓度药物作用的空白组和SCR组，差异均具有统计学意义(P<0.01)。结论: AMO能显著促进DCA体外抗白血病效应，其机制可能与其协助激活hPer3的表达有关。

人周期节律蛋白3； HL-60细胞； 微小RNA-21； 地西他滨

地西他滨(decitabine,DCA)的主要成分5-氮杂-2’-脱氧胞苷酸，为目前已知最强的DNA甲基化特异性抑制剂，主要用于治疗中高危骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes,MDS)，效果较佳，已超越传统药物。MDS是髓系中一组获得性的、造血功能严重紊乱的造血干细胞的克隆性疾病，其特点为髓系中一系或多系血细胞发育异常和无效造血，常在数年后转化为急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)。然而DCA用于治疗AML远不如MDS。微小RNA-21(microRNA-21，miR-21)在多种实体肿瘤[1-2]和部分系列的白血病[3]中呈高表达，应用miR-21反义寡核苷酸(anti-miR-21 oligonucleotide，AMO)在体外对肺癌等实体肿瘤细胞均存在抗肿瘤效益[4]。因此，本研究将AMO转染进入AML HL-60细胞，观察其对DCA的抗AML效益的影响。

材 料 和 方 法

1 反义寡核苷酸链设计

根据miRNA数据库及参考其它文献，设计AMO 5’-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’(22 bp)及随机寡核苷酸(scrambled oligonucleotide,SCR)5’-CAGGAATCGGAACATCAAAGGT-3’(22 bp)，由上海朝瑞生物科技有限公司合成。

2 药品、试剂和仪器

地西他滨粉剂购自Sigma；CD11b-PE、CD117-PE和FITC标记的膜联蛋白-碘化丙啶(Annexin V/PI)凋亡试剂盒购自BD；RNA提取纯化试剂盒购自Promega；Lipofectamine 2000转染试剂盒和Trizol购自Invitrogen；miR-21扩增试剂盒购自ABI；One Step SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR试剂盒购自TaKaRa；小牛血清和RPMI 1640培养液购自Gibco。荧光PCR仪为ABI 7500;CO2培养箱为Jouan IG150;流式细胞仪为BD FACS Calibur，其中获取软件为CellQuest，分析软件为FlowJo;冰冻离心机为Eppendorf 5714R。荧光定量PCR引物:hPer3上游引物为5’-ACAAACAGAACCACAAGGCA-3’,下游引物为5’-CGTCCATTTGTTGGCATTT-3’，扩增产物94 bp；GAPDH上游引物为5’-GACCTGACCTGCCGTCTA-3’，下游引物为5’-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3’，扩增产物148 bp；均由上海生工生物工程公司合成。PCR仪购自Roche。

3 方法

3. 1 细胞培养 AML细胞株HL-60购自中科院上海细胞库。用含10%小牛血清、100 U·L-1青霉素和100 U·L-1链霉素的RPMI-1640培养液在37℃、5% CO2的培养箱中培养，取对数期细胞备用。配制密度为1×108/L的细胞悬液接种于6孔培养板，每孔2 mL，置37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养过夜。

3.2 AMO转染及效率验证、药物处理 AMO和SCR均参照试剂盒说明书经Lipofectamine 2000试剂盒转染到HL-60，并设立空白对照组，AMO和SCR浓度为2 μmol/L，转染时间为6 h，细胞培养液为无血清RPMI 1640。

Trizol抽提转染前后的HL-60细胞总RNA，采用紫外分光光度计测定吸光度，确定其纯度。Real-time PCR检测转染前后的miR-21表达，取3 μg总RNA和3 μL逆转录酶混合，在10 μL逆转录体系中的反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，进行逆转录，然后将逆转录产物cDNA进行150倍稀释。反应体系20 μL，包括2 μL稀释的cDNA和10 μL预混液，ddH2O补足至20 μL。以U6 snRNA作为对照，2-ΔΔCt法计算miR-21相对表达量。HL-60细胞经上述步骤转染后，分别与终浓度0.5、2.0和4.0 μmol/L的DCA作用48 h，每组设6个重复水平。

3.3 Annexin V/PI标记法观察细胞凋亡 3.2步骤中细胞用预冷PBS洗涤弃上清，残渣细胞收集至流式管。每管加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，避光静置15 min，加300 μL预冷的PBS，振荡混匀上机检测其早/中晚期凋亡率。

3.4 分化抗原CD117和CD11b检测 3.2步骤中细胞用预冷PBS洗涤弃上清，残渣细胞收集至流式管。每管依次加CD117-PE和CD11b-PE各5 μL，加300 μL预冷的PBS，振荡混匀上机检测，用FlowJo软件分析平均荧光强度。

3.5 人周期节律蛋白3(human period circadian protein 3，hPer3) mRNA检测 hPer3和GAPDH标准品构建：用Trizol提取细胞总RNA，鉴定完整性和纯度，取5 μg总RNA冰上逆转录成cDNA进行逆转录PCR，反应体系25 μL：其中DNA模板2 μL，10 μmol/L hPer3或GAPDH荧光定量PCR引物各1 μL，5×PCR缓冲液5 μL, 加去RNA酶水补至25 μL，反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72℃ 10 min。PCR反应产物经纯化后，加入连接缓冲液5 μL、纯化的目的片断4.5 μL和pMD18-T载体0.5 μL，低速离心后于16 ℃连接过夜，将连接液转化大肠杆菌DH5α后涂氨苄青霉素平板，挑取单菌落培养过夜，抽提其质粒通过PCR鉴定阳性重组子，送上海生工公司测序确证。将重组质粒倍比梯度稀释作为标准品，用cDNA进行SYBR Green I荧光染料嵌合法检测，反应体系参照试剂说明书，反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 30个循环；72 ℃ 10 min。利用各自的标准曲线分别对样品中的目的基因和内参照基因分别进行定量，白血病细胞株中hPer3 mRNA的相对表达量为hPer3与GAPDH比值。

4 统计学处理

实验数据用均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0软件，对各组中的抑制率、早期凋亡率及分化抗原平均荧光强度采用单因素方差分析和LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 转染效率

空白组(blank组)、SCR转染组(SCR组)和AMO转染组(AMO组)的miR-21相对表达量(U6 snRNA为内参照)分别为0.71±0.07、0.66±0.05和0.35±0.07，AMO-21转染组miR-21表达低于空白组和SCR转染组(P<0.05)。

2 细胞药敏

空白组、SCR组和AMO组DCA的IC50分别为(3.05±0.46) μmol/L、(2.96±0.34) μmol/L和(1.48±0.13) μmol/L，AMO组低于空白组和SCR组(P<0.01)。

3 Annexin V-FITC/PI检测凋亡

各DCA浓度中，AMO组的早期凋亡率均高于同一药物浓度组的空白组和SCR组(P<0.01)，见图1、2。

Figure 1.Early apoptotic rates of HL-60 cells treated with diffe-rent concentrations of DCA. Mean±SD. n=6 **P<0.01 vs blank and SCR at the same DCA concentration.

Figure 2.Representative flow cytometry images of early apoptosis of HL-60 cells treated with DCA at concentrations of 0 and 4.0 μmol/L.

4 分化抗原CD117和CD11b检测

除未加药组(DCA 0 μmol/L)外，各药物浓度组中AMO组的细胞CD117平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)均低于同一浓度组中的blank组和SCR组(P<0.01)。除未加药组(DCA 0 μmol/L)外，各药物浓度组中AMO组的细胞CD11b MFI均高于同一浓度组中的blank组和SCR组(P<0.01)，见图3。

5 hPer3 mRNA检测

各药物浓度组中，AMO组的hPer3 mRNA表达均高于同一药物浓度组的blank组和SCR组，差异均有显著统计学意义(P<0.01)，见图4。

Figure 3.Mean fluorescence intensities of CD117 (A) and CD11b (B) in HL-60 cells treated with different concentrations of DCA. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs blank and SCR at the same DCA concentration.

Figure 4.hPer3 mRNA relative expression in HL-60 cells treated with different concentrations of DCA. Mean±SD. n=6. *P<0.05， **P<0.01 vs blank and SCR at the same concentration.

讨 论

DCA是目前发现的对MDS效果最佳的化疗药物，虽然在临床上MDS和AML能相互转归，但从国外治疗现状来看，对AML单一使用DCA并未取得良好的效果，目前这种机制尚不清楚。目前的研究热点在于如何使用其它药物或手段增强DCA对AML的疗效，使其达到或接近MDS的治疗水平。在此方面近期的研究也取得一些进展，比如作为一种表观遗传学药物，组蛋白去乙酰酶抑制剂丙戊酸钠(VPA)联用在体外[5]和体内[6]均能增强DCA的药效。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类具有高度保守性的内源性非编码蛋白质的小分子单链RNA，其中miR-21在几乎所有实体肿瘤包括胰腺癌中存在高表达，而且高表达的miR-21可能发挥类似原癌基因的作用。在肿瘤细胞中针对性抑制miR-21表达不仅能直接抑制肿瘤细胞增殖的生物学特性，例如敲除或抑制miR-21能有效地抑制一些白血病细胞的生物学特性[7-8]，还能间接地增强一些化疗药物如阿糖胞苷[9]的抗肿瘤细胞的效果。本研究显示，2 μmol/L AMO转染时间为6 h后，HL-60细胞对DCA的IC50降至普通的一半左右，极大提升DCA抑制细胞的效果。同时，AMO和DCA还能共同作用于细胞早期凋亡和分化，CD117作为c-Kit受体膜外区分子表面抗原标志，多数AML的原始细胞中均有CD117的表达，并且CD117的高MFI和细胞的恶性程度相关，往往预示着预后不良[10]。AMO协同DCA降低CD117的MFI从分化抗原角度说明它们能共同作用于降低肿瘤细胞的恶性程度。CD11b是泛髓系标记，主要表达于粒系、单核等髓系细胞，其表达量和细胞成熟度呈正相关，AMO和DCA能共用提升HL-60细胞的CD11b MFI，并且从流式直方图上显示，4.0 μmol/L浓度DCA和AMO共同作用后，肿瘤细胞已经分化为一个幼稚群(低MFI峰)和一个成熟群(高MFI峰)，这意味着AMO和DCA能共同促进幼稚髓系肿瘤细胞向成熟髓系细胞转化。

已有的研究显示：miR-21常见的直接作用靶标有PTEN[11]、PDCD4、TIMP3、bcl-2等基因, 通过与靶基因mRNA 3’-UTR 完全或不完全互补配对而调控靶基因的表达。hPer3基因不仅作用于其它时钟基因相关基因的调节，还直接作用于细胞周期调控，在体内表达降低易引起肿瘤细胞增殖，体外过表达也能引起肿瘤细胞的凋亡[12]。本研究显示，单独的AMO能提升hPer3 mRNA的表达，却幅度不高。将与DCA作用的HL-60细胞经过AMO转染预处理后，却能较大幅度加强DCA促hPer3的表达能力。其原因可能如下：AMO对hPer3的表达影响可能有两方面：正面作用：hPer3可能是miR-21的作用靶标(经TargetScan验证其Pct值为0.69),AMO直接抑制miR-21从而提升了hPer3的表达；反面作用：由于miR-21还能通过直接抑制DNMT1基因上游信号分子RASGRP1而间接抑制DNMT1酶的表达[13]，而AMO的转染恰恰提升了DNMT1酶的作用，抑制了hPer3的表达。未与DCA作用前，两方面的作用相互制衡，以正面作用略占优势。DCA作为一种DNMT酶抑制剂，AMO转染后与大剂量的DCA作用，其反面作用被抑制，从而在大剂量DCA组中观察到hPer3表达的大幅提升。总之，AMO加强DCA的抗白血病效应中有hPer3的激活参与，然而， miR-21对hPer3的靶标作用过程目前尚未完全清楚，还需要在后续的实验研究中进一步验证。

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Enhanced anti-leukemic activity of decitabine to leukemia HL-60 cells by anti-miR-21 oligonucleotide

WANG Ye-kai, YU Qian, LIN Qi-long, YAO Yan-zhen, MEI Pei-yu, LI Yi-wei

(ClinicalLaboratory,ZhoushanHospital,Zhoushan316004,China.E-mail:wangyekai@163.com)

AIM: To investigate the role of anti-miR-21 oligonucleotide (AMO) in the anti-leukemic activity of decitabine (DCA)invitro. METHODS: AMO and scramble oligonucleotide (SCR) were constructed and transfected into HL-60 cells. The miR-21 expression was analyzed by real-time PCR to identify the transfection efficiency. The cells were treated with DCA at gradient concentrations (0.5, 2.0 and 4.0 μmol/L) for 48 h. The mRNA expression of human period circadian protein 3 (hPer3) was detected by real-time PCR. The early apoptotic rates were determined by flow cytometry with Annexin V/PI staining. Mean fluorescence intensities (MFI) of CD117 and CD11b were also measured by flow cytometry. RESULTS: The miR-21 relative expression level in AMO group was significantly lower than that in blank group and SCR group (P<0.01). IC50of DCA in AMO group was significantly lower than that in blank group and SCR group (P<0.01).With the same concentration of DCA, the early apoptotic rate, the mRNA expression of hPer3 and the MFI of CD11b in AMO group were significantly higher than those in blank group and SCR group (P<0.01). The MFI of CD117 in AMO group were significantly lower than those in blank group and SCR group (P<0.01). CONCLUSION: Activation of hPer3 expression plays an important role in enhanced anti-leukemic activity of decitabine by AMOinvitro.

Human period circadian protein 3; HL-60 cells; MicroRNA-21; Decitabine

1000- 4718(2015)01- 0109- 05

2014- 06- 06

2014- 10- 10

舟山市科技局科技计划项目(No.2011C12044)

△通讯作者 Tel: 0580-2292892; E-mail: wangyekai@163.com

R733.7

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.021