Gab2在人骨肉瘤细胞U2-OS中的表达及意义

平 勇， 邸平山， 李卫兵， 李凤梅， 陈为一， 陈萍萍

(东港区人民医院 1骨科， 2急诊科，山东 日照 276800；3五莲县人民医院心内科，山东 日照 262300； 4潍坊医学院病理教研室，山东 潍坊 261053)



Gab2在人骨肉瘤细胞U2-OS中的表达及意义

平 勇1△， 邸平山3， 李卫兵1， 李凤梅2， 陈为一4， 陈萍萍4

(东港区人民医院1骨科， 2急诊科，山东 日照 276800；3五莲县人民医院心内科，山东 日照 262300； 4潍坊医学院病理教研室，山东 潍坊 261053)

目的： 探讨Grb2协同结合蛋白2(Gab2)在人骨肉瘤细胞系中的表达及其与人骨肉瘤细胞侵袭转移的关系。方法: 应用小RNA干扰技术，将合成的小RNA干扰质粒转染给人骨肉瘤U2-OS细胞，采用Western blotting和RT-PCR法检测转染后Gab2的蛋白和mRNA表达水平；体外细胞趋化运动实验和侵袭实验检测细胞的迁移和侵袭能力。结果: Gab2在人骨肉瘤U2-OS细胞系中高表达，且转染Gab2 siRNA后的细胞(SiGab2/U2-OS)中Gab2蛋白及mRNA的表达水平低于转染scramble siRNA细胞(Scr/U2-OS)和U2-OS；趋化运动实验发现在10 μg/L表皮生长因子 (EGF)的诱导下SiGab2/U2-OS细胞的迁移能力较U2-OS和Scr/U2-OS细胞明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)；SiGab2/U2-OS细胞侵袭并穿透Matrigel 膜基质的细胞数量均比Scr/U2-OS细胞和U2-OS 细胞少，SiGab2/U2-OS细胞的体外侵袭能力显著降低(P<0.01)。结论: 利用siRNA干扰技术降低Gab2的表达对人骨肉瘤U2-OS细胞的迁移和侵袭能力有明显的抑制作用。

Grb2协同结合蛋白 2； 小干扰RNA； 细胞侵袭； U2-OS细胞

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是一种最常见的恶性骨肿瘤，占原发恶性骨肿瘤的20%，血行转移早且发生率高，骨肉瘤转移是造成患者死亡的主要原因，是严重影响青壮年身心健康的疾病[1-3]。生长因子受体结合蛋白 2(growth factor receptor-bound protein 2，Grb2)是近几年新发现的一种细胞内分子[4]，系相关结合蛋白家族的成员之一[5]而Grb2协同结合蛋白2(Grb2-associated binding protein-2，Gab2)是一个重要的肿瘤转移调控蛋白，在肿瘤细胞侵袭转移过程中发挥重要作用[6]。有研究证明Gab2具有潜在的原癌基因特性，在肺癌和胶质瘤中呈高表达[7-8]，但尚不清楚Gab2是否参与骨肉瘤的迁移和侵袭。本研究采用小RNA干扰技术抑制人骨肉瘤U2-OS 细胞中的Gab2的表达，实验观察Gab2对骨肉瘤U2-OS细胞体外迁移和侵袭能力的影响，从而为控制骨肉瘤的侵袭转移和临床治疗提供新的靶点。

材 料 和 方 法

1 主要试剂

鼠抗人Gab2抗体、羊抗鼠IgG均为Santa Cruz产品；fibronectin购自Sigma； DMEM培养液购自Hyclone；胰蛋白酶、D0018 质粒中量抽提试剂盒、彩色预染蛋白均购自碧云天；胎牛血清购自杭州四季青公司；迁移和侵袭实验所用24孔细胞培养板购自Corning；Matrigel膜基质购自北京威格拉斯公司；24孔Transwell板、细胞转染试剂购自康为世纪。Gab2的目标片段5'-GTGAGAACGATGAGAAATA-3' 的小RNA干扰质粒和scramble(Scr)序列的小RNA干扰质粒均由上海吉玛公司构建；人骨肉瘤U2-OS细胞株由潍坊医学院科研中心实验室提供。

2 方法

2.1 细胞培养和转染 人骨肉瘤U2-OS细胞株培养于DMEM/F10培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。取对数生长期的U2-OS细胞做实验，细胞分3组：(1)U2-OS细胞：常规培养，不做任何处理；(2)Scr/U2-OS细胞：瞬时转染插入具有一段scramble序列的质粒作对照；(3)SiGab2/U2-OS细胞:瞬时转染插入干扰Gab2具有目标片段5’-GTGAGAACGATGAGAAATA-3’的质粒。转染步骤参照转染试剂说明书。

2.2 RT-PCR实验 取对数生长期的各组细胞，利用Trizol提取总RNA并反转录为cDNA。应用RT-PCR试剂盒测定细胞中的Gab2的 mRNA水平，以β-actin作为内参照。具体操作步骤和引物参照文献[9]进行。取5 μL 的PCR产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳，观察拍照。

2.3 Western blotting实验 将转染后细胞培养72 h后，提取蛋白。行SDS-PAGE分离蛋白，转膜，5%脱脂奶粉封闭，滴加Gab2的I 抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，结合 II 抗孵育后曝光显影。

2.4 趋化运动实验 将细胞重悬，终浓度为0.5×109cells/L。在小室下层板中加入含0、1、10、100和1 000 μg/L 表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)的培养液，在上层板和下层板之间加入1张预先用0.001% fibronectin、4 ℃包被过夜的8 μm的滤膜。将细胞悬液加入上层板中，每孔50 μL。然后将趋化小室放入孵育箱，37 ℃、5% CO2，经孵育3 h后，将滤膜上层细胞刮去，洗涤并染色，在400倍显微镜视野下观察计数。每孔随机取3个视野，其和作为该孔细胞数。

2.5 体外侵袭能力的检测 按文献[7]操作，在小室下层加入10 μg/L EGF刺激，结果置400倍显微镜下观察5个高倍镜视野，计数Transwell小室下室面的细胞数即为穿透人工基膜的细胞数，每个实验重复3次，取平均数作为实验结果。

3 统计学处理

计量数据采用均数±标准差(mean±SD)表示，符合方差齐性的用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)，以P<0.05为差异有统计学意义。用SPSS 16.0软件做实验数据的统计学处理。

结 果

1 Western blotting实验检测Gab2蛋白的含量

对瞬时转染后的细胞继续培养72 h，提取蛋白，经Western blotting实验检测Gab2蛋白的含量。灰度扫描定量显示，U2-OS细胞、Scr/U2-OS细胞和SiGab2/U2-OS细胞中均可见Gab2蛋白表达，与β-actin的灰度比分别为1.00、0.98和0.36，但SiGab2/ U2-OS组中Gab2蛋白的条带亮度明显降低，差异较大，说明小RNA干扰质粒转染成功，见图1。

Figure 1.Determination of Gab2 protein expression by Western blotting in U2-OS cells, Scr/U2-OS cells and SiGab2/ U2-OS cells.

2 RT-PCR实验检测Gab2 mRNA的表达

应用凝胶图像分析仪对Gab2和β-actin的条带作灰度分析，并对Gab2的 mRNA表达强度做出半定量分析，结果显示SiGab2/U2-OS细胞中Gab2 的mRNA条带亮度明显低于Scr/U2-OS细胞和 U2-OS细胞，差异较大，该结果进一步证明了小RNA干扰质粒转染成功，Gab2基因表达被抑制，建立Gab2低表达的实验细胞组，为后续实验提供了条件，见图2。

Figure 2.The mRNA expression of Gab2 was detected by RT-PCR in U2-OS cells，Scr/ U2-OS cells and SiGab2/ U2-OS cells.

3 趋化运动实验

经EGF的诱导后，通过观察细胞计数并绘图发现，U2-OS细胞和Scr/ U2-OS细胞具有很强的趋化运动能力，且呈现“钟形”曲线，10 μg/L的EGF为最佳趋化浓度。U2-OS和Scr/ U2-OS细胞的趋化指数分别是7.74±0.30和7.78±0.33，差异无统计学意义。SiGab2/ U2-OS细胞的趋化运动能力明显降低，趋化指数为3.31±0.29，与U2-OS和Scr/ U2-OS细胞相比差异显著(P<0.01)。提示降低U2-OS细胞中Gab2蛋白的表达确实抑制了细胞定向迁移的能力，见图3。

Figure 3.The effects of Gab2 expression on the chemotactic ability of U2-OS cells，Scr/ U2-OS cells and SiGab2/ U2-OS cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs U2-OS.

4 体外侵袭实验

细胞体外侵袭实验显示，U2-OS细胞、Scr/U2-OS细胞和SiGab2/ U2-OS细胞的穿透细胞数分别为47±8、48±10和26±2；与U2-OS细胞、Scr/ U2-OS细胞相比转染小RNA干扰质粒成功后SiGab2/U2-OS细胞组穿过8 μm微孔滤膜细胞数目明显减少，差异显著(P<0.01)；2个对照组之间相比差异无统计学意义，见图4。

讨 论

骨肉瘤是常见的恶性骨肿瘤之一，多发生于青壮年，该肿瘤恶性程度高，侵袭能力强，通过血道出现肺部转移早。Gab2是1个由1 870个氨基酸残基构成的大分子蛋白质, 又被命名为Akt磷酸化增强子(Akt phosphorylation enhancer，APE)[10]，是支架蛋白Gab家族的重要成员，在人类癌症的发生和发展过程中扮演着重要的角色[6]，Gab2的缺失可以降低小鼠髓系的异常增生现象[11]。有研究表明在肿瘤的发生发展过程中Gab2作为重要的潜在驱动因子起着不可或缺的作用[12]。骨肉瘤细胞的趋化运动是肿瘤生长和侵袭的关键一步，在骨肉瘤细胞侵袭中发挥重要作用，且贯穿于骨肉瘤细胞侵袭的全过程。

Figure 4.The invasion abilities of U2-OS cells, Scr/U2-OS cells and SiGab2/ U2-OS cells. A: the microscopic images of the invading cells (×400); B:the number of invading cells in five high power fields.Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs U2-OS.

本文将带有Gab2目标片段的小RNA干扰质粒转染到人骨肉瘤U2-OS细胞株，建立了Gab2瞬时表达的SiGab2/U2-OS细胞，并用Western blotting 法检测证实了Gab2蛋白在人骨肉瘤U2-OS细胞中有高表达，其在SiGab2/U2-OS细胞中的表达则明显降低。我们同时做了细胞体外趋化实验和体外侵袭实验，以观察Gab2蛋白表达降低对骨肉瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。结果显示SiGab2/U2-OS 细胞的迁移和侵袭能力明显降低，且与Scr/U2-OS细胞和U2-OS细胞相比差异显著。这一结果证实降低Gab2的表达确能抑制人骨肉瘤U2-OS细胞的迁移和侵袭能力，明确提示 Gab2参与了调控骨肉瘤的迁移和侵袭的过程，进而可能在骨肉瘤的迁移和侵袭中发挥重要作用。而关于Gab2在调控骨肉瘤细胞迁移和侵袭的分子机制，有待进一步研究。

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Expression of Gab2 in human osteosarcoma U2-OS cells

PING Yong1, DI Ping-shan3, LI Wei-bing1, LI Feng-mei2, CHEN Wei-yi4, CHEN Ping-ping4

(1DepartmentofOrthopaedics;2EmergencyDepartment,ThePeople’sHospitalofDonggangRegion,Rizhao276800,China;3DepartmentofCardiology,ThePeople’sHospitalofWulianRegion,Rizhao262300,China;4DepartmentofPathology,WeifangMedicalUniversity,Weifang261053,China.E-mail:ppyy2000@163.com)

AIM: To investigate the expression of Grb2-associated binding protein 2 (Gab2) in human osteosarcoma cells and its relationship with the invasion and metastases of human osteosarcoma cells. METHODS: The technique of small RNA interference was used to transfect human osteosarcoma U2-OS cell lines. Western blotting and RT-PCR were used to detect the protein and mRNA expression of Gab2 in transfected U2-OS cells. After transfection, through chemotaxis and invasion assaysinvitro, the cell migration and invasion abilities were detected. RESULTS: After transfection, the expression of Gab2 at mRNA and protein levels in Gab2 siRNA transfected cells (SiGab2/U2-OS) was lower than that in scrambled siRNA transfected cells (Scr/U2-OS) and U2-OS cells. After stimulation with epidermal growth factor (EGF) at concentration of 10 μg/L, the migration SiGab2/U2-OS cells was significantly less than Scr/U2-OS cells and U2-OS cells (P<0.01). The number of invasion cells of SiGab2/U2-OS group was significantly lower than the other 2 control groups (P<0.01). CONCLUSION: Inhibition of Gab2 expression obviously attenuates the migration and invasion abilities of human osteosarcoma U2-OS cell line.

Grb2-associated binding protein 2; Small interference RNA; Cell invasion; U2-OS cells

1000- 4718(2015)03- 0568- 04

2014- 06- 18

2014- 12- 31

△通讯作者 Tel： 0633-8022967； E-mail： ppyy2000@163.com

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.033