Maxadilan对人脂肪干细胞的影响*

连瑞玲, 郭晓令, 郭永龙 , 刘 庆, 陈建苏, , 3△

( 暨南大学 1附属第一医院眼科， 2再生医学教育部重点实验室， 3医学院眼科研究所，广东 广州 510632)



Maxadilan对人脂肪干细胞的影响*

连瑞玲1, 郭晓令2, 郭永龙2, 刘 庆1, 陈建苏1, 2, 3△

( 暨南大学1附属第一医院眼科，2再生医学教育部重点实验室，3医学院眼科研究所，广东 广州 510632)

目的： 探讨垂体腺苷酸环化酶激活肽Ⅰ型受体(PAC1受体)特异激动剂maxadilan对人脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ASCs)的增殖、凋亡和分化潜能的作用。方法: 取人脂肪组织通过酶消化法分离培养ASCs。流式细胞术鉴定ASCs表面标志物，并进行ASCs向成骨成脂定向诱导。CCK-8法和流式细胞术检测maxadilan对ASCs活性的影响。采用波长为254 nm的紫外线(ultraviolet C，UVC)照射ASCs，CCK-8法测定不同剂量的UVC诱导ASCs凋亡后的吸光度。选择剂量为702 J/m2的UVC照射ASCs 24 h后，用流式细胞术和caspase 3和caspase 9试剂盒检测maxadilan对ASCs凋亡的影响。结果: 流式细胞术检测表明细胞CD29、CD44、CD59和CD105表面抗原阳性，证实所提取的细胞是ASCs。CCK-8法检测发现80 nmol/L 浓度的maxadilan对ASCs 促增殖作用最强，流式细胞术分析也证实80 nmol/L maxadilan处理显著促进ASCs的增殖，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。与仅被702 J/m2UVC照射的ASCs比较，80 nmol/L maxadilan 显著抑制同等剂量UVC照射ASCs所诱导的、与caspase 3 和caspase 9活性相关的细胞凋亡，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。同时，2组细胞成骨和成脂的诱导分化均为阳性。结论: Maxadilan 促进ASCs增殖，抑制ASCs凋亡，且不改变细胞向成骨和成脂诱导分化的潜能。Maxadilan有利于ASCs的体外生长与扩增。

Maxadilan； 短波紫外线； 脂肪干细胞

人脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ASCs)来源于人体脂肪组织的基质成分中，具有间充质干细胞固有的生物学特性[1]。与其它来源的间充质干细胞相比较，由于它从通过微创手术获取的组织中提取的量相对较多[2]，因此，在未来的再生医学，软组织修复，美容等领域有较大的需求[1]。但仍存在细胞来源有限，细胞提取易污染，扩增能力局限等问题。因此，寻找一种药物作为ASCs培养液的添加剂来帮助其扩增是非常有必要的。

垂体腺苷酸环化酶激活肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide, PACAP)是一种神经营养肽。有研究证明PACAP及其I型(PAC1)受体特异激动剂maxadilan能促进多种细胞的增生[3-4]。但目前文献有关maxadilan对ASCs的作用报道尚不多见，本实验通过maxadilan对ASCs处理，探讨maxadilan对其增殖、凋亡及分化潜力的影响，为进一步开发ASCs的应用潜能提供实验依据。

材 料 和 方 法

1 材料与试剂

脂肪组织来源于暨南大学附属第一医院和华美整形美容医院行抽脂手术的肥胖患者，标本采集均获得当事人同意并签订知情同意书。Maxadilan由暨南大学生物工程研究所余榕捷教授惠赠。LG-DMEM培养基 (HyClone)；胎牛血清(Gibco)；0.25% 胰酶、胶原酶Ⅰ和青、链霉素(Life Technologies)；油红O染色试剂盒(上海亚培生物科技有限公司)；苏木精-伊红染色液(舜田生物有限公司)；茜素红染液(上海杰美基因医药科技有限公司)；caspase 3及caspase 9检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)； Annexin V-FITC试剂盒(深圳晶美生物有限公司)；CCK-8试剂盒(Vazyme)；CM-10便携紫外观察箱(上海熙浩实业有限公司)。

2 方法

2.1 脂肪干细胞的分离与培养 无菌条件下通过抽吸手术获取患者腹部皮下脂肪组织并将其移入离心管，摇匀静置分层，吸下层弃除，向离心管中加入与组织量等体积的PBS反复冲洗。然后用吸管吸取已预热的0.1% I型胶原酶与脂肪组织等体积混匀，置于气浴恒温振荡器(37 ℃、100 r/min)进行消化，振荡50 min，1 291 r/min离心5 min。小心去除上清，加入0.3%氯化钠重悬，放入培养箱裂解10 min。1 291 r/min离心5 min。去除上清，重复2次，用100目的筛网过滤，将滤液1 291 r/min离心5 min。用低糖培养基重悬细胞后，最后将其接种至50 mL培养瓶中。置入37 ℃、5% CO2恒温培养箱进行培养，48 h后去除未贴壁的细胞，以后每3 d换液1次，待细胞贴壁达80%～90%，用0.25%胰蛋白酶对上述细胞消化，进行传代培养。取第2代细胞进行相关检测。

2.2 流式细胞术鉴定ASCs的表型标志 用0.25%胰酶消化ASCs，用PBS制作单细胞悬液，以3×105个细胞分别与抗CD29、CD34、CD44、CD45、CD59、CD105和HLA-DR抗体于室温下反应30 min，然后用PBS清洗2次，再与FITC标记的II抗避光反应15 min。将洗涤后的细胞用PBS重悬后，用流式细胞仪检测分析。

2.3 CCK-8法检测maxadilan处理对ASCs增殖的影响 用胰酶消化ASCs后，将其接种到96孔培养板上，每孔5×106/L细胞。培养板置于37 ℃、5% CO2培养箱，待细胞贴壁达80%～90%时，向以上培养板中分别加入浓度为0、60、80、100、120 nmol/L 的maxadilan, 不同浓度分别设定6个复孔，继续培养24 h，每孔中分别加入10 μL CCK-8溶液，置于培养箱培养2 h后，使用多功能酶标仪测定各孔于波长450 nm的吸光度值(A)。

2.4 流式细胞术分析maxadilan处理对ASCs细胞周期的影响 1×109/L的ASCs接种于6孔培养板。实验组培养液中添加80 nmol/L maxadilan，对照组不添加maxadilan，每组2个复孔。置于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h后，实验组、对照组细胞用0.25% 胰蛋白酶消化5 min，收集细胞并用预冷的PBS洗涤1次，之后加入1 mL预冷的75%的乙醇，放置EP管内轻轻吹打混匀，4 ℃过夜后离心(2 000 r/min、10 min)弃上清，加入500 μL预冷的PBS，重悬，离心(2 000 r/min、10 min)，小心将上清液弃去，加入0.2 mL的碘化丙啶染液，室温下避光反应15 min，用滤膜过滤，流式细胞仪分析细胞周期。

2.5 Maxadilan处理对ASCs细胞凋亡的影响 建立紫外线诱导ASCs的凋亡模型，用胰酶消化ASCs后，将其接种到96孔培养板上，每孔5×106/L细胞，待细胞贴壁达80%～90%时，向以上培养板中分别用剂量为0 J/m2(0 s)、117 J/m2(30 s)、234 J/m2(1 min)、468 J/m2(2 min)、702 J/m2(3 min)和936 J/m2(4 min)且波长为254 nm 的紫外线(即短波紫外线，ultraviolet C, UVC)进行照射，之后在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h，每孔中分别加入10 μL CCK-8溶液，置于培养箱培养2 h，使用多功能酶标仪测定各孔于波长450 nm的吸光度值。

将1×109/L的ASCs接种于6孔培养板。后续选用702 J/m2的UVC，并用80 nmol/L maxadilan处理细胞。细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h后，用0.25% 胰蛋白酶消化5 min，收集细胞，PBS清洗2次，1 000 r/min离心、5 min。 弃上清，加入200 μL binding buffer重悬细胞，加入5 μL的Annexin V-FITC，室温避光孵育10 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，先加入200 μL binding buffer混匀，后加入5 μL PI染液染色，流式细胞术定量分析细胞的凋亡状况。

2.6 检测细胞内caspase 3及caspase 9活性 按流式细胞术定量分析细胞凋亡相同的方法分组和处理细胞，用0.25% 胰酶消化贴壁细胞，将其转至新的培养液中，低速4 ℃离心5 min，去上清，PBS洗涤，加入裂解液(每200 万个细胞加入100 μL裂解液)，轻摇匀使其重悬，置冰浴反应15 min，之后放入离心机，4 ℃、16 000 r/min离心15 min，取上清至预冷的EP管中，按说明书向96孔板中加入试剂后混匀， 每组3个复孔，置37 ℃、5% CO2培养箱过夜，待有明显的颜色变化时，使用多功能酶标仪测定各孔样品于波长405 nm的吸光度值，UVC单独处理组与UVC+maxadilan组减法对照组吸光度即为样品中caspase 3和caspase 9催化底物对应产生的吸光度。

2.7 ASCs在体外的成脂诱导 选取第2代细胞，用0.25% 胰酶消化后接种到6孔培养板上，每孔5×107/L细胞，在37 ℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁达90%～100%后，将培养基更换为成脂诱导培养基(低糖DMEM，10% 胎牛血清，1% 双抗，1 mmol/L地塞米松，10 mmol/L胰岛素，0.5 mmol/L IBMX，200 mmol/L吲哚美辛, 同时添加80 nmol/L maxadilan孔作为实验组，添加诱导培养基孔为对照组，每3 d更换1次培养基，继续培养2 周后，分别取对照组和实验组细胞依次进行油红O和苏木精-伊红双染，以证实2组细胞中是否有脂滴的形成。

2.8 ASCs在体外的成骨诱导 细胞处理方法同成脂诱导实验，后更换成骨诱导培养基(低糖DMEM，10% 胎牛血清，1% 双抗，10 mmol/L β-磷酸甘油钠，0.1 μmol/L地塞米松，50 mg/L 2-磷酸化抗坏血酸)，只添加诱导培养基为对照组，另添加80 nmol/L maxadilan为实验组，每3 d换1次液，诱导2 周后发现细胞出现大量的钙化节，用PBS清洗细胞后用纯丙酮固定15 min，茜素红进行染色，在倒置显微镜下拍照。

3 统计学处理

所用资料为3次独立实验的结果。应用SPSS 13.0统计软件建立数据文件，计量资料数据以均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)；多个实验组与一个对照组比较，选用Dunnett法。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 ASCs表型标志物的表达

流式细胞术检测结果显示细胞CD29、CD44、CD59和CD105表达呈阳性，提示分离的细胞具有间充质干细胞的特征；CD34、CD45和HLA-DR表达阴性，提示分离的细胞不是血源细胞，见图1。

2 Maxadilan处理ASCs后细胞的增殖及细胞周期检测

CCK-8法检测结果显示maxadilan可以促进ASCs增殖，其中，80 nmol/L 的maxadilan组比对照组细胞增多17%，差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术的分析结果显示：80 nmol/L maxadilan处理ASCs的细胞周期增殖指数(PI)为8.30%，与对照组5.13%相比，差异有统计学意义 (P<0.05)，表明经过80 nmol/L maxadilan处理的ASCs处于增殖期的细胞数增多，见图2。

Figure 2.The effects of maxadilan on the viability of human ASCs. A: the effects of maxadilan at various concentrations on the viability of ASCs detected by CCK-8 assay; B: the effect of 80 nmol/L maxadilan on the proliferation of ASCs detected by flow cytometric analysis. Mean±SD. n= 3. *P<0.05 vs control.

3 Maxadilan对UVC照射ASCs凋亡后的作用

CCK-8法检测分别暴露于117 J/m2、234 J/m2、468 J/m2、702 J/m2和936 J/m2的UVC对ASCs增殖的影响，未用UVC照射的ASCs作为对照组。234 J/m2、468 J/m2、702 J/m2和936 J/m2的UVC明显抑制ASCs的增生，照射后的细胞比对照组分别减少10.8%、13.7%、18.1%和19.6%，差异有统计学意义(均P<0.05)。其后，ASCs先用maxadilan预处理，再照射UVC，细胞凋亡率比单独使用UVC照射低，提示maxadilan对UVC照射ASCs凋亡有明显的抑制作用，见图3。

Figure 3.Establishment of UVC-induced human ASC apoptosis model and flow cytometric analysis of ASC apoptosis with different treatments. A: the effects of maxadilan on ASCs exposed to UVC at various dose; B: the percentage of apoptotic cells in ASCs exposed to 702 J/m2 UVC and treated with maxadilan at 80 nmol/L were measured by flow cytometric analysis. Mean±SD. n= 3. *P<0.05 vs control; ##P<0.01 vs UVC.

4 Maxadilan对UVC照射ASCs的caspase 3和caspase 9活性的影响

80 nmol/L maxadilan作用ASCs 24 h后，caspase 3的活性明显降低，两复孔值分别为0.081±0.001和0.078±0.002，与对照组0.050± 0.001 相比，有统计学意义(P<0.05)。同样，caspase 9的活性明显降低，两复孔值分别为0.070±0.001和0.063±0.001，与对照组0.050±0.002 相比，有统计学意义(P<0.05)，表明maxadilan 对caspase 3和caspase 9具有下调作用。

5 Maxadilan对ASCs干性的影响

5. 1 ASCs对成脂诱导结果 第2代ASCs进行成脂诱导1 周后对照组和实验组细胞均出现单独存在的小脂滴，部分细胞含有多个小脂滴。诱导2 周后脂滴明显变大，脂滴间相互融合变成大的脂滴，折光性很强。依次经油红O和苏木精进行双染，可见细胞的胞浆中有许多大小不等的橙红色脂滴，细胞核被苏木精染成浅蓝色，见图4。

5. 2 ASCs对成骨诱导结果 第2代ASCs进行成骨诱导1 周后对照组和实验组均发现细胞出现钙化节，部分细胞含有钙化现象类似细胞凋亡出现的碎片。诱导2 周后钙化现象明显，钙化结节间相互融合，沙粒样的物质增多。茜素红染色后可见钙化结构被染成红色，见图4。

Figure 4.Adipogenic and osteogenic differentiation of human ASCs in vitro. Scale bar=100 μm.

讨 论

ASCs方便获取，取材对器官损伤性小，使它成为一种比较理想的获取干细胞的来源[2]。但是，ASCs较短的端粒酶、DNA的突变、衰老、凋亡等使得它的体外再生能力有限[5]。近来的研究发现：C型血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)、血小板源性的生长因子、骨形态生长因子、转化生长因子β1(TGF-β1)、乳铁蛋白(lactoferrin，LF)、肺癌的可溶性因子、骨膜蛋白等可以促进ASCs的再生[6-9]。

PACAP是血管活性肠肽家族的一员，它有PAC1、VIP1和VIP2 3种受体[10]。Horvath等[11]发现PACAP可以促进人类增生性绒毛膜外滋养层细胞(human invasive proliferative extravillous cytotrophoblast cells，HIPEC)和视网膜全层细胞的再生。本研究团队也曾发现PAC1受体可以通过其特异性激动剂maxadilan促进多功能干细胞的再生，且能抑制其凋亡[9]。但是该受体对ASCs的效应如何却未见报道。本实验首次证实PAC1受体的特异性激动剂maxadilan对ASCs具有促进增殖和抑制凋亡的作用。

凋亡是维持机体内环境稳态及正常细胞再生所必须的。而凋亡的机制多样，了解ASCs的凋亡机制和maxadilan介导的抗凋亡机制，将有助于更深刻地理解ASCs的临床应用。在参与凋亡过程的许多分子中，caspase扮演着一个重要的角色，它是一种惰性蛋白酶其多种亚型在各种凋亡的刺激下相互作用，相互影响。 Caspase 3就是caspase家族中一种典型的蛋白酶，而caspase 9对caspase 3激活起关键作用。Ying等[7]、Zhao等[12]和Matalia等[13]发现caspse 3和caspase 9参与了紫外线诱导的细胞凋亡且其活性增加。本研究证实，maxadilan可以通过减少caspase 3和caspase 9的活化，来起到抗ASCs凋亡的作用。为进一步了解maxadilan对ASCs分化潜能的影响，我们设立了用maxadilan处理的实验组和未用maxadilan处理的对照组进行成骨和成脂的定向诱导，发现2组都可以诱导成功，提示maxadilan不会影响ASCs向成骨和成脂的定向分化潜能。

总之，我们的结果发现PAC1受体的特异性激动剂maxadilan能够显著增强ASCs的再生，减少紫外线诱导的ASCs凋亡。Maxa-dilan的抗凋亡机制与caspase 3和caspase 9的活性下调有关。同时maxa-dilan并不会影响ASCs的成骨和成脂的定向分化潜能。我们的研究揭示：在ASCs的培养中，maxadilan 可以成为一种抗凋亡的添加剂。

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Influence of maxadilan on human adipose-derived stem cells

LIAN Rui-ling1, GUO Xiao-ling2, GUO Yong-long2, LIU Qing1, CHEN Jian-su1, 2, 3

(1DepartmentofOphthalmology,TheFirstAffiliatedHospital,2KeyLaboratoryforRegenerativeMedicineofMinistryofEdu-cation,3InstituteofOphthalmology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:chenjiansu2000@163.com)

AIM: To investigate the effect of maxadilan, which specifically activates pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor (PAC1 receptor), on the proliferation, apoptosis and differentiation potential of human adipose-derived stem cells (ASCs). METHODS: ASCs from human adipose tissue were isolated by enzymatic digestion and cultured. ASCs were confirmed by the analysis of the markers for cell phenotypes by flow cytometry (FCM) and adipogenic/osteogenic induction. The effect of maxadilan on ASCs viability was analyzed by CCK-8 assay and FCM. ASCs were irradiated by ultraviolet C (UVC) at 254 nm and the absorbance of apoptotic ASCs induced by various doses of UVC was measured by CCK-8 assay. ASCs were exposed to 702 J/m2UVC for 24 h to induce apoptosis. The effect of maxadilan on ASC apoptosis was analyzed by FCM and the determination of caspase 3 and caspase 9 levels. RESULTS: Adipose-derived stem cells were confirmed by the detection of the positive expression of cell phenotypes including CD29, CD44, CD59 and CD105 by FCM. The data of CCK-8 assay revealed that ASCs treated with maxadilan (80 nmol/L) had the strongest ability of proliferation. The data of FCM also demonstrated that the addition of 80 nmol/L maxadilan to ASCs in experimental group markedly improved the proliferation capacity of the cells compared with control group (P<0.05). The apoptosis of ASCs exposed to 702 J/m2UVC was dramatically inhibited by the treatment with maxadilan (80 nmol/L). Such process involved the caspase signaling pathway including caspase 3 and caspase 9. There was statistical significance (P<0.05) between experiment group (ASCs irradiated by UVC and supplemented with maxadilan) and control group (ASCs only irradiated by UVC). Meanwhile, adipogenic and osteogenic differentiation potentials were both positive in experiment group and control group. CONCLUSION: Maxadilan promotes proliferation and inhibits apoptosis of the ASCs. The differentiation potential of ASCs toward adipogenic and osteogenic lineages wouldn’t be altered by maxadilan. Maxadilan would benefit to growth and expansion of ASCsinvitro.

Maxadilan; Ultraviolet C; Adipose-derived stem cells

1000- 4718(2015)03- 0475- 06

2014- 10- 10

2014- 11- 18

国家自然科学基金资助项目(No. 81371689)； 广东省自然科学基金资助项目(No. S2013010013391)

△通讯作者 Tel: 020-85227363; E-mail: chenjiansu2000@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.016