叶酸及维生素B12检测方法的发展及现状

陈伟才　李忠信　渠　海　付光宇★

叶酸及维生素B12检测方法的发展及现状

陈伟才1李忠信2渠海2付光宇2★

［摘要］本文简要概括了人体内叶酸及维生素B12检测方法的发展历史及现状，结合前人研究对现阶段应用最为广泛的化学发光检测方法着重分析，讨论了叶酸及B12检测试剂盒开发过程中常见的困难点，叶酸和B12检测标准的现状，为临床应用工作的展开提出建议。

［关键词］叶酸；维生素B12；化学发光法；检测分析；临床

作者单位：1．广东省佛山市顺德区中医院检验科，广东，佛山528333 2．郑州安图生物工程股份有限公司，河南，郑州450016

The development of detection methods for folic acid and vitamin B12

CHEN Weicai1, LI Zhongxin2, QU Hai2, FU Guangyu2★
(1. Department of Clinical Laboratory, Chinese Medicine Hospital of Shunde District in Foshan City, Foshan, Guangdong, China, 528333; 2. Zhengzhou Autobio Biological Engineering Co.，Ltd．, Zhengzhou, Henan, China, 450016)

[ABSTRACT] In the beginning we made a brief summary of the development history and present situation about the detection of human folic acid and vitamin B12. A further discussion on the chemiluminescence method based on previous studies is conducted, which is most widely used at the present stage. And then we stated the key points during the R&D of Folate & B12detection agents, especially the difficulty in the establishment of standards. Finally we raised some advice to clinical workers.

[KEY WORDS] Folic acid; Vitamin B12; Chemiluminescence; Assay; Clinical

叶酸（folic acid）是与蝶酰谷氨酸（pteroylglutamic acid，PGA）功能和化学结构相似的一类化合物的统称，又称为维生素B9。叶酸是人体必不可少的营养物质，对人体具有重要的生理功能，是人体许多生化反应的辅酶。在人体内叶酸携带一碳单位形成5-甲基四氢叶酸、亚甲基四氢叶酸等活性形式发挥作用，其中5-甲基四氢叶酸是人体内活性叶酸的主要存在形式。研究证实，叶酸除了与巨幼红细胞性贫血有关外，还与新生儿神经管畸形，结肠癌、白血病等癌症，心脑血管疾病以及儿童智力低下有关，也可以导致出生缺陷发生率上升，例如先天性心脏病、唇腭裂以及唐氏综合症等［1］。此外，叶酸缺乏还可以引起早产、流产等不良妊娠的发生［2］。

维生素B12又称氰钴胺素、钴胺素、外源因子、动物蛋白因子，是唯一含有矿物质的维生素。维生素B12贫乏也是巨幼红细胞性贫血症的诱因，同时也与老年痴呆症、抑郁症以及冠心病等有关。

叶酸和B12都是人体内一碳单位转移的重要辅助因子，故在诸多生化反应中都起到协同作用，例如都是DNA合成过程中重要的辅酶，参与DNA合成，降低血浆中同型半胱氨酸水平［3］等。无论是临床检测应用还是学术研究，通常都将二者放在一起，检测方法也极为类似。

叶酸和维生素B12重要临床意义的发现引发了学术界对其的广泛关注，准确而高效的叶酸及B12检测手段也就显得极为重要。但由于叶酸和B12在人体内含量极低，体外稳定性极差，具有生物活性的相关化合物组成复杂等原因，对其分析相当困难［4］，直至今日，对于叶酸和B12的检测标准依然未能够达成共识。

1　叶酸及维生素B12检测方法的发展及现状

经过半个多世纪的研究，学者们根据检测对象的不同开发出了多种检测样品中叶酸或B12的方法，如比色法、薄层层析法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱法、微生物法和同位素放射免疫法等。一般测定原料叶酸或B12、纯叶酸或B12制品或药品制剂中的叶酸或B12质量分数常采用比色法；而生物体、食品中叶酸的测定多采用微生物法、同位素放射免疫法或色谱法、色-质联用法以及最新的离子捕获法，化学发光法和生物传感法。其中微生物分析法，以其经典、准确可靠性为许多国际标准方法机构作为标准方法或第一法［5］，而化学发光法为目前应用最广泛的检测方法。

1．1叶酸及维生素B12检测方法的发展

微生物法和同位素放射免疫法是叶酸和B12检测的经典方法，上世纪欧美针对人群体内叶酸及B12水平的普查以及大量临床研究，均采用这两种方法。但两种方法在准确性上一直有争议。

微生物法的优点是成本低，可操作性强，能够检测到极低浓度的叶酸或B12水平，缺点是由于微生物法不能够区分叶酸或B12的各种形式，所测结果一般为总的叶酸或B12量，准确度较低，重复性较差，无法形成统一标准［6］；同位素放射免疫法利用同位素标记的叶酸或B12受体进行检测，相比微生物法较为便携与迅速，但是放免法采用的叶酸受体对样本中不同形式的叶酸或B12亲和力大不相同，灵敏度较差［7］，并且放免法存在放射线辐射和污染等问题，同时受样本基质、缓冲体系以及pH影响较大，不同试剂盒检测结果偏差较大。

1995年Wilson等［8］提出离子捕获法检测叶酸，样品加入变性剂后叶酸与内源性结合蛋白分离，释放后的叶酸再与带有大量阴离子的亲合试剂结合，合成产物经过离子捕获池而与阳离子纤维结合，最后通过碱性磷酸酶与蝶酸（叶酸的类似物）结合物对叶酸结合蛋白上游离结合位点的探查，定量分析样品中叶酸的质量分数。该研究证实，当离子捕获法测定血清或红细胞中的叶酸时，其结果与同位素放射免疫法的结果具有良好的相关性。

高效液相色谱-质谱联用技术（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLCMS）于1999年最早报道应用于叶酸分析［9］，该技术不仅能够快速、高效地分离叶酸化合物，而且质谱仪的高灵敏度满足了低检测限的要求，具有样品用量少、自动化程度高等优点、无论对定性及定量分析都显示了巨大的优势。目前，利用HPLCMS联用方法检测叶酸化合物主要集中于对食品和临床样品，并且都已显示出较好的应用前景，已逐步成为较为权威的叶酸检测手段。

90年代，有学者相继提出用非放射性标记蛋白结合技术检测血液叶酸，其中包括克隆酶供体免疫测定法（cloned enzyme-donor immunoassay，CEDIA）、ELISA、化学发光受体实验等。化学发光检测法易于实现自动化，检测重现性好，灵敏度较高，对低浓度叶酸样品检测结果明显高于其他方法［10］，是目前临床应用最为广泛的检测方法，本文将对此方法着重介绍。

1．2叶酸及维生素B12的化学发光检测法

1．2．1叶酸

化学发光法检测叶酸目前均采用竞争法的原理，一般使用从牛奶中提取的叶酸结合蛋白（folate-binding proteins，FBP）作为免疫反应的基础。研究证实，此类FBP对血清中叶酸主要的活性结构均有很高亲和力［11］；样本中与内源性叶酸结合蛋白结合的叶酸以及蝶酰多聚谷氨酸则需要经过解离（酸解离，碱解离或酶解离）。

1．2．2维生素B12

化学发光法检测维生素B12也采用竞争法的原理，一般都使用内因子（IF，人体吸收转运B12的重要载体蛋白）作为免疫反应的基础。血清中的维生素B12也需要经解离转变成为游离形式后才能与IF进行结合。另外，由于天然维生素B12在体外并不稳定，通常还需要在预处理环节中添加氰化钾使之转变为稳定的形态［12］。

一直以来，叶酸及维生素B12用以临床推广使用的检测试剂盒的开发十分困难。首先，叶酸和B12的理化性质十分不稳定，暴露在空气中很容易受到光、氧气和金属离子的影响而失去活性。例如Jansen EH，Beekhof PK［13］对叶酸和B12研究发现部分叶酸活性结构在－20℃储存4天含量降低了60%，而B12则至少在－70℃条件才能长期储存。其次，叶酸和B12在人体内具有生物活性的相关化合物组成复杂，而且含量极低，对试剂盒灵敏度和精密度有很高要求；关于叶酸和FBP亲和力的研究也持续了很长一段时期。再有，叶酸和B12本身分子质量太小，用于包被用的叶酸或B12的衍生物和IF抗体制备工艺复杂。

经过各界学者不断的研究，对叶酸和B12检测试剂盒的开发逐渐达成了一些共识：鉴于叶酸和B12的不稳定性，样本在采集、转移和储存过程中需要特别注意环境温度以及光照环境，并依据样本保存条件在规定时间内检测样本以确保检测结果的准确性及临床意义的有效性；抗氧化剂也是一种必须的方法，在各组分的缓冲液中添加抗氧剂，如柠檬酸、抗坏血酸、2－巯基乙醇等，用以保护不稳定的叶酸［14］，并使用不透光容器保存相关组分，最大程度上保护叶酸或B12及其衍生物的稳定性，提高检测结果的稳定性以及精密性；对待检样本进行解离处理，有研究发现，在酸性（pH＝3．5）环境中，约90%以上的叶酸谷氨酸多聚体能够转变为单体形式［15］，另外，碱解离和酶解离也用于许多叶酸、B12分析研究中；由于免疫反应比较严苛，必须保证适宜的pH、电解质环境和排除交叉反应，叶酸维持稳定最适宜的pH与和FBP结合的最适pH存在差异，抗氧剂（如2－巯基乙醇）、解离剂（酸碱或解离酶）都会干扰免疫反应和检测，检测试剂盒开发过程中都必须进行必要的处理和调整；另外，不同平台的化学发光检测系统有不同的发光侦测体系，在辣根过氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）催化发光的体系中，还应特别注意排除全血叶酸检测中血红蛋白（HRP结构类似物）的干扰，有学者进行专项研究，发现合适的阴离子型或非离子型表面活性剂对血红蛋白的有很好的清洁效果［16］。

1．2．3叶酸和维生素B12的化学发光检测法检测标准

虽然在检测原理上，各大厂商基本上达共识，然而，许多学者或机构对不同厂商试剂盒的检测结果进行比对，发现应用最广的几种检测试剂盒在检测结果上仍存在显著差异［15］。在体外诊断行业飞速发展的今天，行业标准的建立意义重大，国际相关知名的标准实验室及组织机构也一直在致力于此方面的研究，如ASCP等。无论是以改良后的微生物测定法还是高效液相色谱—质谱联用法做参比，研究结果发现，各大厂商试剂盒的检测结果存在明显差异，这体现在检测结果与参比方法的比对以及回收实验的结果中［17－18］。

上述学者或机构对这种检测结果的差异进行了调查和统计分析，发现造成这种差异的原因主要集中在以下几个方面：首先，溯源不同，各大厂家在试剂盒开发过程中均采用了不同的溯源途径，有的以WHO标准物质溯源，有的以改良后的微生物测定法作为溯源，有的以上世纪临床与研究应用最为广泛的Bio-Rad公司的同位素放射免疫试剂盒作为溯源，溯源本身就一直存在争议与差异；其次用于校正检验结果的标准物质不同，有的以单体叶酸为标准物质，有的以总叶酸为标准物质，校准曲线的拟合方式也存在差别［19］；校准品的缓冲基质不同，大量研究已经证实，在以FBP作为叶酸检测手段时，校准物质利用血清基质作为缓冲体系时比利用无机盐添加蛋白辅料的缓冲体系所得到的检测结果偏高［7］；另外，对FBP和叶酸以及IF和B12之间结合模型或方式的研究还不够透彻，样本预处理工艺［17］也是各厂家的核心工艺及机密，无法得到有效交流，这都对叶酸和B12检测标准的统一造成了很大的困难；叶酸和B12的临床指标不明确，医学界并未为叶酸和B12规定确切的参照水平，单从目前临床应用讲，各厂家试剂盒均能基本满足临床要求。

高效液相色谱-质谱联用法为叶酸和B12检测标准的建立提供了可行方案，但笔者认为，对叶酸、B12与相应结合蛋白的结合机制，各活性组分相互的转化的研究以及医学界对叶酸、B12检测的引导才是最终统一叶酸、B12检测标准的根本。

2　叶酸和维生素B12检测的临床应用

2007年，国家启动了“出生缺陷干预工程”，全国各大医院也陆续开展了叶酸和B12检测项目。但调查发现，许多叶酸和B12的检测项目在开展过程中存在许多的不足与误区。

首先，需要明确全血叶酸和血清叶酸检测指标。众所周知，全血中的叶酸水平能够反映个体近期真实的叶酸及营养水平，而血清叶酸只能够体现极短时间内个体的叶酸水平，且极易受饮食的影响。全血叶酸的检测指标应受到更多的重视。其次，由于全血叶酸检测步骤远比血清叶酸检测复杂，成本也高出许多，与现阶段临床快速便捷的诊断需要相违背，在全血叶酸检测工艺尚未能够完全满足临床需求的事实下，血清叶酸检测项目的规范化尤为重要。

全球有16．2亿人贫血，而孕前或妊娠中的妇女中这一比例达到42%［20］。铁和叶酸的补充孕前或妊娠中的妇女应特别重视。研究证实，正常人在服用叶酸片后在2 h～4 h内达到峰值，约8小时后趋于稳定，正在参与叶酸补服的孕前或妊娠中的妇女进行叶酸检测时，如果直接进行血清叶酸检测，增补的叶酸停留在血清中尚未被红细胞吸收，检测结果不能够最真实的反应个体叶酸水平。建议在检测个体血清叶酸时前让个体提前2 d～3 d停止补服叶酸，并进行空腹采血。

叶酸和B12的不稳定性对样本的采集和保存提出了较高要求。各厂商试剂盒以及前人学者的研究，一般建议在2 h之内完成对新采集样本的检测，不能及时检测的应置于2℃～8℃环境保存并在8 h内完成检测，－20℃冻存样本应在1w内完成检测，样本在转移和储存过程中应注意冷藏、封闭和避光。

临床应用与研究对叶酸、B12检测手段的进步的重要性不言而喻，对叶酸、B12试剂盒的开发，检测标准的建立有十分重要的意义。在厂商与临床的配合中，临床应用过程中的规范性需要得到广大临床工作者的广泛注意。

综上所述，关于叶酸和维生素B12的检测，准确快捷低成本的全自动化学发光检测法仍将是主流。如此，检测标准的建立迫在眉睫，这需要科研机构的学者专家、临床工作者和各厂商试剂研发实验室的共同努力。一方面需要明确FBP、IF的作用机制，促进叶酸和B12结构形式转变及预处理工艺方面的学术交流并达成共识；另一方面需要临床工作者通过良好的认识和操作为研究反馈真实有效的指导；还需要试剂开发厂商明确工作重点，不盲目迎合并真正致力于临床研究。

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通讯作者：★付光宇，E-mail：fuguangyu＠autobio．com．cn

基金项目：国家高技术研究发展计划（863计划）（2011AA02A101）