β-葡聚糖对单核细胞释放TNF-α、IL-8和IL-12的影响

吴荣强，王苏建，王仕忠，周海俊，戚春建

(1.南京医科大学附属常州第二人民医院检验科，江苏常州213003; 2.南京医科大学附属常州第二人民医院肿瘤研究所，江苏常州213003)

β-葡聚糖对单核细胞释放TNF-α、IL-8和IL-12的影响

吴荣强1，王苏建1，王仕忠2，周海俊2，戚春建2

(1.南京医科大学附属常州第二人民医院检验科，江苏常州213003; 2.南京医科大学附属常州第二人民医院肿瘤研究所，江苏常州213003)

目的研究β－葡聚糖对单核细胞释放动脉粥样硬化致病因子[肿瘤坏死因子α(TNF－α)、白细胞介素18(IL－8)和白细胞介素12(IL－12)]的影响。方法用密度梯度离心法分离健康志愿者新鲜血液中的单核细胞，使用佛波醇酯(PMA)诱导单核细胞分化为巨噬细胞，进一步利用氧化低密度脂蛋白(ox－LDL)诱导巨噬细胞为泡沫细胞，将实验分为无药对照组、ox－LDL组、颗粒性β－葡聚糖(WGP)组和WGP+ox－LDL组，提取总RNA，扩增TNF－α、IL－8和IL－12 cDNA，并采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞上清液中的浓度。结果与无药对照组比较，ox－LDL诱导单核细胞TNF－α、IL－8和IL－12蛋白水平的表达显著升高(P＜0.05)，而WGP可以显著抑制ox－LDL诱导的上述细胞因子在蛋白水平和TNF－α、IL－8在mRNA水平的表达(P＜0.05)。结论β－葡聚糖可能通过抑制单核细胞促炎因子的分泌减缓动脉粥样硬化形成。

β－葡聚糖;低密度脂蛋白;单核细胞

近年来大量研究表明，冠心病是一种慢性进展的炎性疾病，其病理基础是冠状动脉硬化(cronary arteriosclerosis)及斑块形成。聚集于动脉管壁部位的氧化性低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein，ox－LDL)是动脉粥样硬化斑块形成的关键因素[1]。炎性细胞及炎性因子可通过多种组织和病理学机制参与动脉粥样硬化的发生和发展，如巨噬细胞可吞噬ox－LDL形成泡沫细胞并分泌大量的炎症细胞因子从而促进动脉粥样硬化[2]。β－1，3/1，6－葡聚糖是某些酵母、真菌、谷类和藻类的细胞壁D葡萄糖的聚合物，是一种生物应答调节剂。很多β－葡聚糖的实验观察证明其具有显著非特异性的免疫应答和抗氧化活性等生物学功能，能够刺激增强天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞等免疫细胞的吞噬活性，一氧化氮的产生和炎症应答等[3－4]。我们利用一种酵母来源的颗粒性β－葡聚糖(whole beta－glucan particle，WGP)，通过观察WGP对ox－LDL诱导的单核－巨噬细胞表达炎症因子[肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha，INF－α)、白细胞介素8 (interleukin 8，IL－8)和白细胞介素12(interleukin 12，IL－12)]的影响，进一步探讨β－葡聚糖在拮抗动脉粥样硬化方面的作用。

材料和方法

一、材料

WGP获赠于美国路易斯维尔大学严俊教授，佛波醇酯(phorbol myristate acetate，PMA，美国Sigma公司产品)，单核细胞分离液Ficoll－Paque (上海GE生物公司产品)，TRizol试剂盒(Invitrogen公司产品)，反转录试剂盒为Bio－Rad公司的iScript cDNA Synthesis Kits，实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)试剂盒为TaKaRa公司生产的SYBR Premix EX TaqTMⅡ(Perfect Real Time)。细胞因子酶联免疫吸附试验(enzyme－linked immunosorbent，ELISA)测定试剂盒(美国Biolegend公司产品)。

二、方法

1.ox－LDL的制备人血浆LDL提取采用一次性密度超速离心法。新鲜人枸橼酸钾抗凝血液，室温低速离心分离血清，用KBr调密度至1.019～1.063 g/mL，4℃以150 000×g离心5 h，收集LDL，于磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)中透析48 h，超滤除菌后4℃保存。LDL的氧化修饰采用经典硫酸铜方法，将无乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的LDL置于5 μmol Cu2+的PBS中，37℃温育24 h。修饰后的LDL置于含200 μmol EDTA的PBS中透析24 h后4℃保存。修饰程度用硫代巴比妥酸反应物质法测定。未经氧化的LDL丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量为0.12 nmol/mg蛋白，氧化后ox－LDL的MDA含量为28.7 nmol/mg蛋白。

2.单核细胞的分离培养及诱导处理新鲜抗凝血液标本2 mL加入2 mL PBS，人单核细胞分离液4 mL加至PBS稀释的血液标本底部，使液面分层，用密度梯度离心法分离单个核细胞。将单个核细胞悬浮于含10%胎牛血清的RPMI－1640培养液，接种于25 mL培养瓶，在37℃5% CO2的条件下贴壁温育6 h，收集贴壁细胞即为单核细胞。将分离好的单核细胞用含1%胎牛血清的RPMI－1640液重悬，置细胞于24孔培养板(1×106/孔)37℃培养6 h后，加入PMA至终浓度为100 ng/mL，培养48 h后实验分为4组(每组均重复3次)，即无药对照组(继续温育48 h)、ox－LDL组[加ox－LDL(10 μg/mL)温育48 h]、WGP组[WGP(100 g/mL)温育2 h，继续温育48 h]、WGP+ox－LDL组[先加WGP(100 g/mL)温育2 h，之后加ox－LDL(10 μg/mL)继续温育48 h][3，5]。收集上清液离心后冻存于－70℃备用，收集单核细胞用于提取总RNA。

3.总RNA提取和逆转录PCR扩增采用TRizol提取液按异硫氰酸胍－酚－氯仿抽提法提取总RNA，采用核酸蛋白测定仪测定RNA的浓度(A260nm)和纯度(A260nm/A280nm)。cDNA合成按照iScript cDNA Synthesis Kits操作说明进行。以GAPDH为内参，行实时荧光定量PCR，PCR引物见表1(所有引物由上海生物工程公司设计和合成)。实时荧光定量PCR采用SYBR GreenⅠ染料法，按照SYBR Premix EX TaqTMⅡ操作说明书在ABI 7300 real－time PCR仪上进行扩增。20 μL反应总体系:cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL (工作浓度为10 μmol/L)，焦碳酸二乙酯水6 μL，SYBRPremixEXTaqTM10μL，ROX Reference 0.6 μL。反应程序为:95℃30 s;95℃5 s，60℃31 s，共40个循环。采用比较阈值法2－△△Ct计算各细胞因子cDNA，据此间接反映mRNA的相对含量，以同一标本待测指标mRNA含量与内参照GAPDH mRNA含量的比值表示待测基因的表达水平。PCR扩增完成后用熔解曲线分析法确定产物特异性。

4.细胞因子测定参照ELISA试剂盒说明书测定细胞上清液TNF－α、IL－8和IL－12的水平。

三、统计学方法

结果

一、WGP对ox－LDL所致单核－巨噬细胞炎症因子释放的影响

单核－巨噬细胞经10 μg/mL ox－LDL处理48 h后，细胞培养上清液中的TNF－α、IL－8和IL－12浓度明显增加，与无药对照组比较，差异具有统计学意义(P＜0.05)。单核－巨噬细胞经100 g/mL的WGP预处理2 h后加ox－LDL培养48 h，培养上清液中TNF－α、IL－8和IL－12浓度均显著降低，与ox－LDL组比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)。见图1和表2。

表2 各组细胞上清中TNF－α、IL－8和IL－12蛋白量的比较(±s，pg/mL)

注:与无药对照组比较，*P＜0.05;与ox－LDL组比较，#P＜0.05

IL－8IL－12无药对照组组别TNF－α 13.00±1.73500.00±96.15115.00±10.39 ox－LDL组38.00±5.57*940.70±91.43*240.70±23.69*WGP+ox－LDL组23.33±4.16#419.00±58.80#106.30±15.82#WGP组15.33±1.53208.30±43.6699.33±14.05

二、WGP对ox－LDL所致单核－巨噬细胞炎症因子mRNA表达的影响

WGP干预后，再用ox－LDL刺激，与ox－LDL组比较，TNF－α mRNA和IL－8 mRNA的表达均显著下调(P＜0.05)，而IL－12无明显下调。见图2。

讨论

动脉粥样硬化是一个复杂的慢性炎症性过程，即在一系列心血管危险因素作用下，脂质代谢产物、细胞代谢产物和碎片沉积于大、中动脉内壁，引起血管内皮功能紊乱，动脉管壁内皮下免疫细胞浸润，引发炎性反应，最终形成动脉粥样斑块[6]。

我们在先前的实验中对心绞痛和急性心肌梗死患者检测了外周血白细胞分类计数(数据未列出)，结果显示急性心肌梗死组患者白细胞计数水平较健康对照组明显升高，而心绞痛组与对照组无明显差异，健康对照组、心绞痛组、急性心肌梗死组的中性粒细胞、单核细胞计数依次升高，且各组之间差异均有统计学意义，而淋巴细胞计数结果显示急性心肌梗死组和心绞痛组均显著低于健康对照组，这些与文献报道相一致[7]。研究结果提示中性粒细胞、单核细胞计数的升高可能反映冠状动脉的病变程度和急性病变的情况。同时，循环中单核细胞富集浸润可能促进巨噬细胞的分化，后者吞噬大量氧化修饰的LDL，导致细胞内脂质堆积直至形成粥样硬化斑块。

在本研究中，我们发现健康志愿者单核－巨噬细胞与ox－LDL共同培养48 h后，单核－巨噬细胞上清液中TNF－α、IL－8和IL－12蛋白含量明显增加，提示ox－LDL促进炎症因子的分泌和表达，从而促进巨噬细胞向泡沫细胞分化。给予WGP预处理后，继用ox－LDL刺激，与ox－LDL组相比，细胞培养上清液中TNF－α、IL－8和IL－12的蛋白含量明显减少，巨噬细胞TNF－α mRNA和IL－8 mRNA表达明显下调，说明WGP具有一定的抑制ox－LDL诱导单核－巨噬细胞分泌炎症因子的作用。

β－葡聚糖的活性结构是由葡萄糖单位组成的多聚糖，它能够活化多种免疫细胞(如巨噬细胞、嗜中性粒细胞)，全面刺激机体的免疫系统。ROVENSKY等[8]发现β－葡聚糖对大鼠佐剂性关节炎有抗炎镇痛作用，且该作用可能与其抗氧化作用有关。KARUMUTHIL－MELETHIL等[9]也发现应用酵母聚糖A(提取自酵母细胞壁)免疫可以预防或延缓NOD小鼠1型糖尿病的发病。另有报道，Curdlan(由粪产碱杆菌产生的葡聚糖)可以诱导CD4+T细胞生成白细胞介素10 (interleukin 10，IL－10)，并抑制变应性气道炎症的发生，提示葡聚糖可能是通过抑制或促进促炎因子的释放来发挥其抗炎和抗氧化的功能[10]。

β－葡聚糖因其特有的生理功能，受到了广大科学工作者的关注和研究，并已成功应用于制药工业和保健品业。其中，几丁聚糖(β－1，4－聚－葡萄糖胺)已经被应用到临床治疗动脉粥样硬化[11]。在本研究中，我们发现β－1，3/1，6－葡聚糖也能抑制ox－LDL诱导单核－巨噬细胞促炎因子的表达，从而拮抗动脉粥样硬化。可以预见，在冠心病将来的治疗措施中，β－葡聚糖是一种潜在的抑制斑块以及全身炎性反应、稳定粥样斑块的有效治疗药物。

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The influence of beta-glucan on TNF-α，IL-8 and IL-12 in monocytes

WU Rongqiang1，WANG Sujian1，WANG Shizhong2，ZHOU Haijun2，QI Chunjian2.(1.Department of Clinical Laboratory，Changzhou Second People's Hospital，Nanjing Medical University，Jiangsu Changzhou 213003，China;2.Oncology Institute，Changzhou Second People's Hospital，Nanjing Medical University，Jiangsu Changzhou 213003，China)

ObjectiveTo study the influence of beta－glucan on tumor necrosis factor alpha(TNF－α)，interleukin 8(IL－8)and interleukin 12(IL－12)in atherosclerosis pathogenesis monocytes.MethodsThe monocytes of healthy subjects were separated by density gradient centrifugation.The monocytes were induced into macrophages by phorbol myristate acetate(PMA)，and the macrophages were induced into foam cells by oxidized low－density lipoprotein (ox－LDL).There were control group，ox－LDL group，whole beta－glucan particle(WGP)group and WGP+ox－LDL group，the total RNA was extracted，and the TNF－α，IL－8 and IL－12 cDNA was amplified.The concentrations in supernates were determined by enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA).ResultsCompared with control group，the protein expression of TNF－α，IL－8 and IL－12 in monocytes were significantly up－regulated by ox－LDL(P＜0.05).After pretreated with WGP，the protein expressions of TNF－α，IL－8 and IL－12 and the mRNA expressions of TNF－α and IL－8wereinhibitedsignificantly(P＜0.05).Conclusionsbeta－glucanmayinhibitedox－LDL－induced pro－inflammatory effects in macrophages，which attenuates the development of atherosclerosis.

Beta－glucan;Low－density lipoprotein;Monocytes

1673－8640(2015)03－0280－04

R446.62

A

10.3969/j.issn.1673－8640.2015.03.019

2014－06－06)

(本文编辑:姜敏)

国家自然科学基金资助项目(81272323);江苏省自然科学基金资助项目(BK2011244);教育部第46批留学回国人员科研启动基金资助项目

吴荣强，男，1982年生，学士，主管技师，主要从事临床生物化学检验研究。

王苏建，联系电话:0519－88132707。