治疗性HPV DNA疫苗的研究进展

徐思慧，曹保利

(1.天津中医药大学 研究生院，天津300193;2.天津南开医院 妇产科，天津300100)

2008年在全世界范围内估计有53 万宫颈癌新发病例，约有27万人死于宫颈癌。宫颈癌是仅次于乳腺癌和结直肠癌的第三大女性常见的癌症[1]。高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)持续感染是子宫颈癌发生发展最重要的致病因素[2]。目前，预防性HPV 疫苗已应用于临床，但是对于已经感染HPV的妇女并没有作用，因此治疗性HPV DNA疫苗的研究逐渐成为近年来研究的焦点。

1 HPV 及致癌机制

1.1 HPV

HPV是一种双链DNA 病毒。HPV的基因组功能区主要由早期区，晚期区和长控区组成。早期区包括E1，E2，E4，E5，E6和E7。E1 参与病毒DNA复制，E2 参与病毒基因的转录、复制及维护，E4 可能与病毒从宿主细胞释放有关，E6 编码抑制细胞周期的蛋白，可抑制促进细胞凋亡的P53 基因，E7 编码与肿瘤抑制因子Rb 结合的蛋白，从而使细胞周期紊乱。晚期区包括主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白，编码病毒晚期的结构蛋白，形成完整的病毒颗粒。长控区位于E区和L区之间，调节病毒DNA 复制和基因表达[3-4]。

目前已识别的HPV 达200种，大约有40种左右通过性接触感染生殖道。这些感染生殖道的HPV根据其致癌潜能，可以分为高危型和低危型，高危型HPV 导致的宫颈癌占所有宫颈癌的95%，其中HPV16和18是宫颈癌最常见的HPV类型，低危型HPV 可引起良性尖锐湿疣[2，5]。

1.2 HPV 致癌机制

高危型HPV表达癌基因E6和E7是导致宫颈上皮癌变发生的重要因素。HPV 基因序列与宿主细胞基因组整合，使E2 失活，进而使癌基因E6和E7 过表达，从而破坏细胞周期[6]。E6 蛋白可以与E6 相关蛋白(E6-associated protein，E6-AP)结合形成E3 泛素化酶，再与P53 蛋白结合，使P53 蛋白降解，从而使细胞周期失控而使细胞永生化[7-8]。在正常情况下，肿瘤抑制因子Rb 与p107、p130 和E2F形成复合物，来阻止静止期细胞进入细胞周期，同时调节细胞凋亡和分化过程。而E7 蛋白可以与Rb结合，使Rb/E2F 复合物解离，解除Rb 蛋白的抑制作用，使静止期细胞进入细胞周期，进而使细胞永生化[5]。

2 治疗性HPV DNA疫苗

2.1 治疗性HPV DNA疫苗的作用机理

治疗性HPV DNA疫苗是将编码HPV 抗原蛋白的DNA 直接导入机体内，外源基因编码目的蛋白，诱导机体产生细胞免疫和体液免疫应答。DNA疫苗被导入宿主细胞后，可在细胞内表达抗原蛋白，一部分抗原蛋白在蛋白酶体降解成多肽，通过抗原肽转运蛋白进入内质网腔中，与主要组织相容性复合体Ⅰ类分子和β2 微球蛋白结合，再运输到细胞膜表面，供CD8+T 淋巴细胞识别，诱导细胞免疫反应[9]。另一部分抗原蛋白在溶酶体降解成多肽，与主要组织相容性复合体Ⅱ类分子结合，呈递到细胞表面，激活CD4+T 淋巴细胞，诱导免疫反应。与此同时，在CD4+T 淋巴细胞辅助下，抗原蛋白刺激B 细胞产生中和抗体，诱导体液免疫[10]。

2.2 治疗性HPV DNA疫苗的优缺点

治疗性HPV DNA疫苗优点[11-13]:1)制作简单，成本低;2)在室温下性质稳定，热稳定性好，便于储存和运输;3)不需要佐剂;4)抗原持续表达，增强免疫记忆;5)不需要载体就能诱导免疫反应;6)可以重复给药;7)相比于HPV 活病毒和细菌载体疫苗，DNA疫苗相对安全;8)可同时诱导体液免疫和细胞免疫。

治疗性HPV DNA疫苗缺点[12，14]:1)转染宿主细胞效率低，缺乏细胞类型特异性，并且不具备在体内扩增和扩散到周围细胞的能力，所以免疫原性低;2)外源的DNA 插入到宿主细胞基因组中有可能引起肿瘤抑制基因失活或原癌基因激活。

2.3 治疗性HPV DNA疫苗改进方法

2.3.1 疫苗递送途径的选择:简单的DNA疫苗注射转染效率低，而使用基因枪和电穿孔等方法可提高DNA疫苗导入细胞的转染效率。基因枪转染是在较高速度下用包裹DNA的金颗粒轰击组织转染细胞。而电穿孔是将细胞暴露在足够高的电场中，使细胞膜通透性瞬时增加，促进宿主细胞对DNA疫苗的摄取，提高细胞免疫反应。用电穿孔、基因枪和肌肉注射3种方法传递HPV DNA疫苗，结果显示相比于肌肉注射，电穿孔和基因枪表现出更好的抗肿瘤性，电穿孔法产生数量最多的E7 特异性细胞毒性CD8+T细胞[15]。

2.3.2 增加免疫佐剂:接种治疗性HPV DNA疫苗其功效是有限的。因此，可以通过使用免疫佐剂来增强疫苗的免疫应答。HPV E7 DNA疫苗联合白细胞介素-2(interleukin，IL-2)或IL-5 比单独使用疫苗的抗肿瘤作用好，伴随着干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)和细胞毒性T 淋巴细胞裂解活性的增加，IL-2作为佐剂效果优于IL-5，而在HPV E7 DNA疫苗联合IL-2的基础上增加4-1BB 受体可将肿瘤治愈率由7%～27%提高至27%～67%，不仅提高了肿瘤治愈率，而且延长了肿瘤免疫记忆时间[16]。

此外，将高度优化的CpG 基序插入到质粒骨架中，用电穿孔技术传递HPV DNA疫苗给小鼠，通过Elispot 分析显示IFN-γ 和颗粒酶B表达增强，使细胞免疫应答增强，具有良好的抗肿瘤效果[17]。结核分枝杆菌热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)和α-神经酰胺可以作为佐剂，使HPV16 E7 DNA疫苗能诱导强烈的E7 特异性CD8+T细胞应答，显著提高抗肿瘤效应[18-19]。

2.3.3 微粒包裹疫苗:用可生物降解的聚合物微粒ZYC101a 包裹HPV 16和18的编码E6、E7 蛋白的质粒DNA 片段，采用多中心、随机双盲对照方法，将组织活检证实为CIN 2/3的女性随机分成安慰剂组和ZYC101a 组，第一次注射后6个月，受试者行宫颈锥切术，在年龄小于25岁的女性中，ZYC101a 可促进CIN2/3的消退，并且ZYC101a 具有良好的耐受性和安全性[20]。

2.3.4 联合放/化疗:相比于单独使用HPV DNA疫苗或单独放射治疗，低剂量放射与钙网蛋白融合HPV 16 E7的突变型联合治疗表达E7的TC-1 肿瘤，在治疗小鼠的肿瘤和脾中产生数量最多的E7特异性CD8+T细胞，并显著增强了治疗肿瘤作用[21]。化疗药物环磷酰胺可抑制调节性T细胞，从而使调节性T细胞无法抑制细胞毒性CD8+T细胞的功能，因此低剂量的环磷酰胺可增强HPV DNA疫苗的抗肿瘤作用[22]。此外，芹菜素与HPV16 E7-HSP70 DNA疫苗联合治疗TC-1 肿瘤使肿瘤细胞更容易溶解，通过产生最多数量E7 特异性CD8+T细胞从而达到有效的抗肿瘤目的。并且，在体外通过增加芹菜素的剂量可增强使肿瘤细胞凋亡的作用[23]。Toll 样受体7 激动剂咪喹莫特和血管破坏剂5，6-二甲基占吨酮-4-乙酸(5，6-dimethylxanthenone-4-acetic acid，DMXAA)分别与治疗性HPV DNA疫苗联合使用可增强DNA疫苗诱发的抗肿瘤效果[24-25]。

2.3.5 其他:此外，优化编码子可有效改善HPV DNA疫苗效能。优化编码子的HPV DNA疫苗具有较高的免疫原性，并且已证明在动物模型中可诱导强烈的细胞免疫和体液免疫[13]。

3 展望

治疗性HPV DNA疫苗具有广阔的临床应用前景，但将治疗性HPV DNA疫苗应用于临床，仍然需要提高其安全性和免疫原性。随着研究的不断深入和技术不断完善与成熟，相信不久的将来可降低由HPV 感染所引起的宫颈癌发生率。

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