桑葚果醋发酵条件的优化

徐 佳，高 萌

（江西中医药大学，江西 南昌 330004）

桑葚（Fructus mori）是桑科桑属植物成熟果穗的统称（又名桑果），营养价值很高，既可食用又可入药，且汁浓似蜜，香甜可口，被誉为“民间圣果”[1]。桑葚果实中含有1.17%的蛋白质、2.15%的脂肪、4.4%的糖类、6.6%的可溶性固形物、0.47%的矿物质、0.56%的有机酸。此外，还富含维生素（如VC、VB1、VB2）及胡萝卜素等[2]。我国传统医学认为，桑葚能补益肝肾、黑发明目、养血生津[3]。鉴于桑葚的诸多营养保健功能，被卫生部正式列为首批“既是食品又是药品”的名单[1]。

与粮食醋相比，果醋富含有机酸和维生素，其营养保健功能和口感更佳。桑葚果醋以新鲜压榨的桑葚果汁为主要原料，经微生物发酵而成，不仅包含一般食醋的保健功能，而且具有桑葚的生理功能，如解除疲劳，消除肌肉疼痛，降低血压，分解血胆固醇，预防动脉硬化和心血管病的发生，增加食欲，促进消化，保护皮肤等作用[4]。随着我国消费者营养保健意识的日益增强，对营养保健品的需求也越来越高，桑葚加工成的食品目前却未很好地被开发利用[5]，然而它所具有较高的医疗保健功能，必定能在国内市场上受到广大消费者的青睐[6]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料

桑葚：市购。

1.1.2 菌种

醋酸菌A32：江西农业大学实验基地；安琪酿酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.1.3 培养基

酒精发酵基本培养基：将处理好的桑葚汁用蔗糖调整至所需糖度，用0.1 mol/L柠檬酸调其pH值至4，于250 mL三角瓶分装100 mL，80 ℃灭菌10 min[7]。

醋酸发酵基础培养基：1%葡萄糖，1%酵母膏，调pH值至5.5，121 ℃灭菌15 min冷却至70 ℃后移加4%vol的无水乙醇[8]。

1.2 仪器与设备

YXQ-SG46-280S全自动高压灭菌锅：上海博迅实业有限公司；XHZ-30台式恒温摇床：上海堪鑫仪器设备有限公司；LRH-70生化培养箱：上海合恒仪器设备有限公司；WW163附温糖度计：深圳博大精科实业有限公司；LWGY酒精浓度计：广州铭睿电子科技有限公司；HH-6双浴六孔恒温水浴锅：上海乔跃电子有限公司；CPA6202S电子天平：德国塞多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葚果醋加工工艺流程[9]

1.3.2 酒精发酵试验

在酒精发酵基本培养基中加入酵母菌，参照文献[10-11]，研究酵母接种量（5%、10%、15%、20%、25%）、发酵温度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）、糖度（8%、10%、12%、14%、16%）对酒精发酵的影响。并在单因素试验的基础上进行正交试验，正交试验因素与水平见表1。

表1 桑葚果醋酒精发酵正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for mulberry alcoholic fermentation conditions optimization

1.3.3 醋酸发酵试验

将活化的醋酸菌A35接入醋酸菌液体种子培养基中，于30 ℃、150 r/min的条件下摇床培养2 d，得到醋酸菌种子液，分别研究初始酒精度（2%vol、4%vol、6%vol、8%vol、10%vol）、醋酸菌接种量（4%、8%、12%、16%、20%）、发酵温度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）3个因素对桑葚果醋发酵的影响，并在单因素试验的基础上确定以下正交因素与水平，见表2。

表2 桑葚果醋醋酸发酵正交试验因素与水平Table 2 Factors and levels of orthogonal tests for mulberry acetic acid fermentation conditions optimization

1.3.4 测定方法

酒精度测定[12]：蒸馏法；糖度测定：糖度计法[12]；产酸量（以醋酸计）测定[13]：酸碱滴定法。

2 结果与分析

2.1 桑葚果汁酒精发酵试验

2.1.1 酵母接种量对酒精发酵的影响

在酒精发酵基本培养基中加入蔗糖调节糖度至10%，分别接种5%、10%、15%、20%、25%的酵母液，每个接种量设3个平行试验，于30 ℃的恒温培养箱中发酵4 d后取样测定酒精度，结果见表3。

表3 酵母菌接种量对酒精度的影响Table 3 Effect of yeast inoculum on alcohol content

由表3可知，酒精度随着酵母接种量的增加呈增长趋势，当酵母接种量为15%时酒精度最高，为6.1%vol。随着接种量的进一步增加，酒精度反而降低，因此，过高的酵母接种量可能会导致培养基营养的大量消耗而影响酒精发酵。因此，酵母接种量15%为宜。

2.1.2 发酵温度对酒精发酵的影响

在酒精发酵基本培养基中加入蔗糖调节糖度至10%，接种15%的酵母液，分别置于26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃恒温培养箱中发酵，每个温度设置3个平行试验，培养4 d后取样测定酒精度，结果见表4。

表4 发酵温度对酒精度的影响Table 4 Effect of fermentation temperature on alcohol content

由表4可知，温度达30 ℃时酒精度最高，为5.8%vol，因此，温度为30 ℃桑葚果汁酒精发酵最佳。

2.1.3 糖度对桑葚果汁酒精发酵的影响

在酒精发酵基本培养基中接入15%的酵母液，用蔗糖分别调整糖度为8%、10%、12%、14%、16%，每个糖度设置3个平行试验，于30 ℃恒温培养箱中发酵，培养4 d后取样测定酒精度，结果见表5。

表5 糖度对酒精发酵的影响Table 5 Effect of different sugar content on alcohol content

由表5可知，酒精度随着糖度的增加呈增长趋势，当糖度达到14%时酒精度最高为6.5%vol。随着糖度的进一步增加，酒精度反而降低，糖浓度过高反而会对酒精发酵产生抑制作用。因此，糖度14%为宜。

2.1.4 桑葚果汁酒精发酵的正交试验

为了确定桑葚果汁酒精发酵的最佳工艺条件，在单因素试验的基础上，采用L9（33）正交试验，考察酵母接种量、发酵温度、糖度3个因素对酒精度的影响，正交试验结果见表6，方差分析见表7。

由表6可知，各因素对酒精度的影响次序为A（酵母接种量）＞C（糖度）＞B（温度）；酒精发酵的理论最佳组合为A2B2C3，即酵母接种量15%，温度30 ℃，糖度16%，在此条件下酒精度为6.3%vol。由表7可知，酵母接种量对试验有显著影响（P＜0.05）。

表6 桑葚果醋酒精发酵正交试验结果与分析Table 6 Results and analysis of orthogonal tests for mulberry alcoholic fermentation conditions optimization

表7 桑葚果醋酒精发酵正交试验的方差分析Table 7 Variance analysis of orthogonal tests for mulberry alcoholic fermentation conditions optimization

2.2 桑葚果醋发酵试验

2.2.1 初始酒精度对桑葚果醋发酵的影响

在醋酸发酵基础培养基中加入95%无水乙醇用以调整酒精度至2%vol、4%vol、6%vol、8%vol、10%vol和6%种子液，分别于120 r/min、30 ℃恒温摇床培养，每个浓度设置3个平行试验。每隔1 d取样测定酸度，计算产酸量，结果见图1。

图1 初始酒精度对产酸量的影响Fig.1 Effect of initial alcohol concentration on acid production

从图1可以看出，初始酒精度为4%vol～8%vol时，醋酸菌种发酵旺盛，醋酸产量高，在第5天达到最大值；随着酒精含量升高，产酸量反而降低。由此可以确定醋酸发酵的最适酒精度为4%vol～8%vol。

2.2.2 醋酸菌接种量对桑葚果醋发酵的影响

在醋酸发酵基础培养基中分别接入4%、8%、12%、16%、20%的醋酸菌种子液，用95%vol乙醇调节酒精度至8%vol，分别于120 r/min、30 ℃恒温摇床培养，每个接种量设置3个平行试验。每隔1 d取样测定酸度，计算产酸量，结果见图2。

图2 接种量对产酸量的影响Fig.2 Effect of acetic acid bacteria inoculum on acid production

从图2可以看出，接种量为16%时，产酸量在第5天达到最高值。

2.2.3 不同温度对桑葚果醋发酵的影响

在醋酸发酵基础培养基中接入16%的醋酸菌种子液，用95%vol乙醇调节酒精度至6%vol，分别放置温度26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃，120 r/min的恒温摇床上培养，每个温度设置3个平行试验。每隔1 d取样测定酸度，计算产酸量，结果见图3。

图3 温度对产酸量的影响Fig.3 Effect of temperature on acid production

从图3可以看出，发酵温度为30～34 ℃时，醋酸菌种发酵旺盛，醋酸产量高，在第5天达到最大值；由此可以确定发酵醪的最适温度为30～34 ℃。

2.2.4 桑葚果醋发酵的正交试验

为了确定桑葚果醋发酵的最佳工艺条件，在单因素试验的基础上，采用正交试验L9（34），考察醋酸菌接种量、发酵温度、初始酒精浓度3个因素对醋酸发酵的影响，正交试验结果见表8，方差分析结果见表9。

表8 桑葚果醋醋酸发酵正交试验结果与分析Table 8 Results and analysis of orthogonal tests for mulberry acetic acid fermentation conditions optimization

表9 桑葚果醋酸发酵正交试验的方差分析Table 9 Variance analysis of orthogonal tests for mulberry acetic acid fermentation conditions optimization

由表8可知，各因素对醋酸发酵的影响次序为A（酵母菌接种量）＞B（温度）＞C（初始酒精度），醋酸发酵的最佳组合为A3B2C3：醋酸菌接种量20%，初始酒精度8%vol，发酵温度32 ℃。在此条件下进行验证试验，产酸量达为51.34 g/L。由表9可知，3个因素均对试验结果无显著影响。

2.3 成品质量指标

根据以上试验确定的醋酸发酵的最佳组合，在醋酸发酵基础培养基中接入20%的醋酸菌种子液，用95%vol乙醇调节酒精度至8%vol，120 r/min，32 ℃恒温摇床上培养，5 d后，测定其产酸量达51.34 g/L，并观察其感官指标，测定其理化及微生物指标。

2.3.1 感官指标

色泽：紫红色，有光泽。香气：具有醋香和桑葚特有的果香。滋味：无不良异味，酸中微甜。体态：基本澄清，无沉淀。

2.3.2 理化指标

可溶性无盐固形物≥0.50 g/100 mL；酸（以醋酸计）≥3.5 g/100 mL；砷（以As 计）≤0.5 mg/kg；铅（以Pb 计）≤1.0 mg/kg；铜（以Cu 计）≤10.0 mg/kg；氨基酸态氮（甲醛法）：0.18 g/100 mL[14]。

2.3.3 微生物指标

细菌总数≤100个/mL；大肠杆菌≤3 MPN/100 mL；致病菌：不得检出[15]。

3 结论

本试验采用摇瓶液态发酵法，通过桑葚汁的酒精发酵和醋酸发酵两个阶段的研究，确定了桑葚果醋发酵的最优条件。结果表明，桑葚果汁酒精发酵的最佳工艺参数为温度30 ℃、糖度16%、酵母菌接种量20%，发酵周期4 d，在此条件下酒精度为6.3%vol；桑葚果醋发酵最佳工艺参数为温度32 ℃、酒精度8%vol、醋酸接种量20%，在此条件下产酸量达为5.13 g/L。

[1]金 杰，李志西，张 锋，等.桑葚醋提取物抗氧化性的研究[J].中国酿造，2005，24（10）：20-22.

[2]史清龙，樊明涛，马兆瑞.营养型桑葚酒加工工艺的研究[J].酿酒，2005，32（6）：78-79.

[3]徐辉艳，濮智颖，王汉屏，等.桑葚果醋发酵工艺条件的研究[J].食品工业科技，2009，30（2）：164-165.

[4]魏宗萍，李志西，于修烛，等.桑葚醋减肥作用的动物实验研究[J].中国酿造，2005，24（12）：5-7.

[5]马锦军，周象海，王照红，等.桑葚深加工研究进展[J].广西蚕业，2013，50（3）：50-54.

[6]王鸿飞，李和生，韩素珍，等.桑葚的加工利用[J].宁波大学学报，1999（12）：81-84.

[7]张庆华，孔令保，朱向东，等.苹果醋发酵条件的优化研究[J].安徽农业科学，2009，37（32）：15974-15976，15983.

[8]徐 佳，占诗艳.醋酸菌发酵条件优化的研究[J].安徽农业科学，2014，42（6）：1792-1794.

[9]郑瑞婷，刘长海，蔡素华.苹果醋酿造工艺研究[J].广东农业科学，2010（6）：140-142.

[10]韩翠萍，张秀玲，将国龙.苹果醋加工工艺的研究[J].北方园艺，2003（4）：78-79.

[11]瞿玮玮，顾立众.苹果醋叠式动态表面发酵技术研究[J].食品科技，2004，29（7）：67-69.

[12]顾小清，高伟娜.液态深层发酵苹果醋关键技术的研究[J].中国酿造，2007，26（10）：67-70.

[13]张永凤，卢红梅.优良醋酸菌的分离纯化[J].食品研究与开发，2007（10）：89-91.

[14]南 亚.桑葚保健果醋工艺研究[J].食品科技，2008，33（3）：82-84.

[15]刘玉静.桑葚营养保健饮料的研制[J].粮油加工与食品机械，2004（3）：64-67.