冠心病心血瘀阻证患者尿液代谢组学的通路分析*

陈 夏，郑景辉△，梁 健，简维雄，秦伟夫，刘华盛，王 伟，吴发胜，付 蕾，赵晓芳，吴 诚

(1.广西中医药大学附属瑞康医院心血管内科，南宁 530011;2.湖南中医药大学中医诊断研究所，长沙 410007;3.广西中医药大学第一附属医院，南宁 530023)

冠心病心血瘀阻证患者尿液代谢组学的通路分析*

陈 夏1，郑景辉1△，梁 健1，简维雄2，秦伟夫1，刘华盛1，王 伟3，吴发胜1，付 蕾1，赵晓芳1，吴 诚1

(1.广西中医药大学附属瑞康医院心血管内科，南宁 530011;2.湖南中医药大学中医诊断研究所，长沙 410007;3.广西中医药大学第一附属医院，南宁 530023)

目的:探讨冠心病心血瘀阻证患者尿液代谢组学的通路。方法:通路的生物学分析使用KEGG数据库进行检索和构建，代谢产物分子注释、相关的酶或转运蛋白及其相关性质分析使用HMDB代谢组学数据库进行检索，代谢产物路径可视化采用MetPA网络软件构建。结果:冠心病心血瘀阻证患者代谢通路显示，6个差异性代谢产物共参与了10条代谢路径，其中“半乳糖代谢”、“酮体的合成和降解通路”影响值分别为0.00276和0.0000。结论:冠心病心血瘀阻证患者中“半乳糖代谢”、“酮体的合成和降解通路”发生变化参与其病理过程。

代谢组学;心血瘀阻证;代谢通路;半乳糖代谢;酮体的合成和降解

尿液是人体代谢终产物之一，机体大部分生理病理过程的代谢终产物通过尿液排出体外。本课题组［1-4］前期运用GC-MS开展了从大鼠到患者不同研究对象的冠心病血瘀证代谢组学研究。其中在对冠心病心血瘀阻证患者、冠心病非心血瘀阻证患者及健康组3组尿液代谢组学鉴定中发现，葡萄糖、甘油、木糖醇、马尿酸、油酸酰胺、丙酮为冠心病心血瘀阻证患者尿液生物代谢产物谱。本研究在已经确定的代谢产物谱的基础上，利用MetPA、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)、HMDB(The Human Metabolome Database)等数据库的生物学信息，分析冠心病心血瘀阻证患者相关的代谢过程，为中医学证候本质研究提供支持［5］。

1 材料与方法

1.1 代谢谱来源

本课题组前期实验中冠心病心血瘀阻证患者(6例)尿液代谢组学和冠心病非心血瘀阻证患者(16例)及健康组(10例)对比鉴定确定的差异产物:甘油(Glycerol)、油酸酰胺(Acrylamide)、葡萄糖(D-Glucose)、丙酮(acetone)、马尿酸(hippuric acid)、木糖醇(D-Xylito)为冠心病心血瘀阻证尿液代谢产物谱。

1.2 分析软件

代谢通路分析采用 KEGG (http://www.genome.jp/kegg/)、SMP(http://pathman.smpdb.ca/pathways/SMP00020/pathway)数据库检索构建，代谢产物分子注释、相关的酶或转运蛋白及其相关性质分析采用HMDB(http://www.hmdb.ca/)代谢组学数据库进行检索，代谢产物路径可视化采用MetPA网络软件(metpa.metabolomics.ca/)绘制。

1.3 分析方法

将GC-MS质谱分析确定的代谢产物放入MetPA对话框，Compound Label(代谢产物标签)选择输入:Compound name(代谢产物名称);选择物种为:Homo sapiens(人)，Over Representation Analysis (过代表分析);选择:Hypergeometric Test(超几何分布检验)，Pathway Topology Analysis(通路拓扑结构分析);采用:Relative-betweeness Centrality(两中心相关)，然后注册进行通路模型分析。

2 结果与分析

2.1 冠心病心血瘀阻证患者代谢产物生物信息学注释情况

表1显示，对冠心病心血瘀阻证代谢组中6种差异表达产物在KEGG和HMDB数据库中检索，都能找到相应的ID号码，并提供较为详尽的注释。

2.2 冠心病心血瘀阻证患者代谢通路拓扑网络分析

表2图1显示，冠心病心血瘀阻证患者6个差异代谢产物主要参与10条代谢路径，分别是半乳糖代谢、酮体的合成和降解、糖酵解和糖异生、磷酸戊糖途径、甘油脂代谢、丙酸甲酯新陈代谢、苯丙氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、氨基糖和核苷酸糖代谢。

表1 冠心病心血瘀阻证患者代谢组产物生物信息学注释

表2 冠心病心血瘀阻证患者代谢产物MetPA分析结果

图1 冠心病心血瘀阻证患者代谢产物通路的MetPA分析概要图

2.3 冠心病心血瘀阻证患者代谢产物通路分析

表2图1显示，通过对冠心病心血瘀阻证患者代谢产物通路拓扑网络分析发现，半乳糖代谢(Galactose metabolism)和酮体的合成与降解(Synthesis and degradation of ketone bodies)的影响值分别为0.00276和0.0(P＜0.05)，而其他通路影响值均P＞0.05。所以，以半乳糖代谢和酮体的合成与降解通路作为冠心病心血瘀阻证患者代谢组产物的主要通路，并做进一步的分析。

2.3.1 半乳糖代谢通路 图2显示，半乳糖代谢通路在整个通路的原始P=0.0040673，拓扑分析影响值为0.00276;代谢谱中的甘油(C00116)和葡萄糖(C00031)两种代谢产物参与了通路，其中甘油是在半乳糖基(C05401，Galactosylglycerol)的下游，葡萄糖为果糖(C00095，D-Fructose)、密二糖(C05402，Melibiose)和蔗糖(C00089，Sucrose)的共同中间产物。

2.3.2 酮体的合成和降解通路 图3显示，这条通路在整个通路的原始P=0.014879，拓扑分析影响值为0.0;在酮体的合成和降解通路中，代谢谱中的丙酮(C002076)物参与了通路代谢，是乙酰乙酸(C00164，Acetoacetic acid)的产物。

3 讨论

图2 冠心病心血瘀阻证患者半乳糖代谢通路结构图

图3 冠心病心血瘀阻证患者酮体的合成和降解代谢通路结构图(图中所示为KEGG ID，浅色背景的化合物即为本研究结果中参与代谢产物)

代谢组学作为后基因时代的一种全新的组学技术，利用高分离效率、高灵敏度及极低检测限的仪器，以生物体内低分子量物质的动态规律变化来阐释生物体的生理病理变化趋势，最终通过还原相关联生物事件，揭示生物体的病理生理变化实质和机制所在。以往对代谢组学经典的分析方法是找出差别表达的代谢产物，而未见针对代谢产物进行生物信息学分析。随着生物信息学海量数据的产生，怎样把这些数据转化成知识是摆在我们面前的重要课题。本研究根据以往的研究结果，采用生物信息的方法建立冠心病心血瘀阻证患者尿液代谢通路的拓扑网络图，进一步解释代谢产物的生物学过程，为阐释中医证候的本质提供理论支持。

半乳糖是由乳类食物中的乳糖水解而来，其代谢主要是通过半乳糖激酶(galactokinase，GALK)、半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶(galactose-1-phosphate，uridyltransferase，GALT)、尿苷二磷酸半乳糖-4-差向酶 (uridine diphosphate-4-galactose epimerase， GALE)及其所催化的酶促反应转变为葡萄糖而被利用。此外，半乳糖还可通过代谢旁路还原为半乳糖醇或氧化为半乳糖酸。本研究中发现，代谢产物中甘油和葡萄糖参与了半乳糖代谢通路，这两种产物在路径中位于反应的终端，说明在冠心病心血瘀阻证的病理变化中，半乳糖的代谢具有重要作用，是提供缺血心肌能量的重要物质。可能是心肌在缺血状态下，蛋白质分解供能不足，心肌的能量供应由快速分解产生能量的糖代谢来提供。

酮体包含乙酸乙酯、β-羟基丁酸和丙酮，这3种物质由脂肪酸β-氧化或其他代谢所产生的乙酰辅酶A进入三羧酸循环进行氧化分解而成，所以酮体是人体利用脂肪分解产生能量后的中间产物。值得注意的是，由于肝脏缺乏转硫酶和乙酰乙酰硫激酶，所以肝脏氧化脂肪酸时能产生酮体，但不能利用酮体。而肝外组织则相反，在脂肪酸氧化过程中不产生酮体，却能氧化由肝脏生成的酮体，这样肝脏把碳链长的脂肪酸分解成分子较小易被其他组织供能的酮体，为肝外组织提供可利用的能源。对于不能利用脂肪酸的脑组织来说，利用酮体作为能源具有重要意义，同样情况下心肌缺血、缺氧发生坏死病理状态下，由于心脏组织中没有脂肪贮备供能，也需要利用酮体作为主要的能量来源，这成为临床治疗中保护心肌、提供能量的借鉴思路。

本实验首次通过模式识别以及通路分析方法构建了冠心病心血瘀阻证患者尿液代谢物相互作用网络图。独特的通路分析方法可以全局性地描绘出生物化学的扰动以及病理损伤的潜在机制，为进一步揭示中医证候本质、中医药多因多效多靶点的作用机制提供思路。当然这些潜在的代谢通路或靶点尚需通过生物学实验和临床观察进一步验证。

［1］简维雄，黄献平，陈清华，等.基于气相色谱-质谱的大鼠心血瘀阻证血浆代谢组学研究［J］.中华中医药学刊，2009，27 (4):796-798.

［2］简维雄，陈清华，黄献平，等.大鼠心血瘀阻证心肌组织代谢组学的研究［J］.中国中西医结合杂志，2012，32(4):515-520.

［3］简维雄，袁肇凯，黄献平，等.冠心病心血瘀阻证血浆代谢组学的检测分析［J］.中国中西医结合杂志，2010，30(6):579-584.

［4］简维雄，袁肇凯，黄献平，等.冠心病心血瘀阻证尿液代谢组学的检测分析［J］.中医杂志，2010，51(8):729-732.

［5］Xia J，Wishart DS.MetPA:a web-based metabolomics tool for pathway analysis and visualization［J］.Bioinformatics，2010，26 (18):2342-2344.

R541.4

A

1006-3250(2015)01-0069-03

2014-09-23

广西科学研究与技术开发计划项目(2013DA38021)-基于系统生物学方法中药复方对BMSCs作用靶点及转导通路的研究;广西壮族自治区教育厅科研项目(201203YB113)-基于代谢组学的冠心病心血瘀阻证特征研究;广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项课题(GZPT1219)-冠心病血瘀证遗传特征的研究;广西壮族自治区卫生厅科研课题(Z2012181)-广西地区冠心病血瘀证遗传特征研究

陈 夏(1977-)，女，广西南宁人，主治医师，医学学士，从事中西医结合心脑血管疾病的临床与基础研究

△通讯作者:郑景辉(1976-)，男，山东滨州人，副教授，医学博士，从事心脑血管疾病的中西医结合临床与基础研究，Tel:0771-2238816，15277103622，E-mail:jinghuizheng@yeah.net。