益母草与马齿苋配伍对早孕大鼠不完全流产子宫出血的影响

董自波，李 超△，洪 敏，

(1.济川药业集团有限公司，江苏泰兴 225400;2.南京中医药大学，南京 210046)

益母草与马齿苋配伍对早孕大鼠不完全流产子宫出血的影响

董自波1，李 超1△，洪 敏2，

(1.济川药业集团有限公司，江苏泰兴 225400;2.南京中医药大学，南京 210046)

目的:观察益母草与马齿苋配伍对早孕不完全流产大鼠的出血量、血液流变学、部分激素水平及子宫雌激素受体和孕激素受体表达的影响。方法:应用米非司酮和米索前列醇造成早孕大鼠不完全流产子宫出血模型，观察药物对出血量、血液流变性的影响，检测子宫匀浆液中ET和NO的含量及放免法检测血液激素水平和免疫组化法观察子宫雌激素受体、孕激素受体表达的变化，研究药物对子宫出血模型大鼠的效应及机制。结果:益母草与马齿苋配伍可减少子宫NO分泌，提高局部TGF-β水平，减少子宫出血量。结论:益母草与马齿苋配伍能明显缓解米非司酮和米索前列醇导致的早孕大鼠出血症状。

药物流产;放免法;免疫组化法;血液流变性

益母草与马齿苋配伍是临床用于治疗功血的经验方。功能失调性子宫出血(dysfunctional uterine bleeding，DUB)简称功血，系指由于下丘脑-垂体-卵巢轴功能失调，而非生殖道器质性病变所引起的、以月经失调为特征的异常性子宫出血。本研究应用米非司酮和米索前列醇制备大鼠不完全流产模型，研究益母草与马齿苋配伍对该模型与功能性子宫出血相关的内分泌功能、血液流变学的相关变化影响。

1 实验材料

1.1 实验动物

健康SD清洁级大鼠，雌性体质量220～250 g，雄性体质量250～300 g，购自河南省实验动物中心(合格证号SCXK(豫)2005-0001)。

1.2 受试药物

益母草与马齿苋配伍浸膏，江苏济川制药有限公司提供(批号101204)。临用前以蒸馏水配制到所需浓度，大鼠低、中、高剂量分别为0.54 g浸膏/ kg、1.08 g浸膏/kg、2.16 g浸膏/kg。

1.3 药品及试剂

宫血宁胶囊(云南白药集团股份有限公司，批号20090908)、米非司酮片(浙江仙居制药股份有限公司，批号090401)、米索前列醇片(北京紫竹药业有限公司，批号430701094)、阿司匹林(南京制药厂，批号990418)、二甲苯(上海久亿化学试剂有限公司，批号20060101)、地塞米松(郑州卓峰制药厂，批号9031641)、缩宫素注射液(上海第一生化药业有限公司，批号080705)、水合氯醛(成都市科龙化工试剂厂，批号20081206)、肝素钠(北京索莱宝科技有限公司)、36%乙酸(南京化学试剂厂)、ET放免试剂盒(购于北京北方生物技术研究所)、TGF-β1 ELISA 试剂盒(RAT-TGFβ1ELISA KIT，LOT: E09E0709)、考马斯亮蓝(购于南京建成生物工程研究所)。

1.4 仪器

普通显微镜;电子分析天平(上海精密仪器有限公司);DK-600型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司);Z-323台式离心机(德国 TM公司);Spectra Max 190酶标仪(美国AD公司);LG-R-808血液流变分析仪(北京中勤世帝科学仪器有限公司);荧光多功能显微镜(BX60，日本OLYMPUS公司);图像获取系统(DP71，日本 OLYMPUS公司);形态图像分析软件(南京大学捷达公司);石蜡切片机(RM2145，德国LEICA公司);全自动组织仪(TP1020，德国LEICA公司);切片漂烘温控仪(QPB，安徽电子科学研究所);γ放射免疫计数器(GC-1200，科大创新股份有限公司中佳分公司)。

2 方法

2.1 模型的建立［1］

大鼠于下午16时进行阴道涂片检查，将其按发情前期、发情期、发情后期、间期分笼，于18时将发情前期与发情期大鼠按2∶1与雄性大鼠合笼，次日早晨8时阴道涂片观察，以发现精子为妊娠第1天。于第7天分别灌胃米非司酮(8∶00)和米索前列醇(18∶00)，同时于阴道内置入定量棉球1个(棉球重70～80 mg，用塑料薄膜包裹半侧，以防血液漏出和尿液返流)。次日分别于8∶00和18∶00将棉球取出，放入塑料袋中密闭冷藏保存，同时置换1个新棉球于阴道内，观察阴道出血情况，连续至第14天处死动物，将收集的每鼠阴道棉球进行出血量测定。

2.2 分组与给药

将妊娠大鼠按随机数字表法分为模型组、益母草与马齿苋配伍(0.54 g浸膏/kg、1.08 g浸膏/kg、2.16 g浸膏/kg)组、宫血宁胶囊组，取未妊娠雌性大鼠作为空白对照组。造模成功后，次日(第8天)益母草与马齿苋配伍(0.54 g浸膏/kg、1.08 g浸膏/ kg、2.16 g浸膏/kg)组、宫血宁胶囊组(0.0702 g/ kg)均10 mL/kg灌胃给药，空白对照组、模型组分别灌胃等体积生理盐水，每天1次，连续7 d。用药结束后(妊娠第15天)每组颈总动脉取血检测血流变，取子宫进行其他指标测定。

2.3 出血量的测定［1～4］

取颈总动脉血0.02 mL，加入50 g·L－1NaOH溶液4 mL中混匀待用。将收集的每只老鼠子宫出血棉球分别置于烧杯内，根据出血量的情况加适量50 g· L－1NaOH浸泡挤压搓洗棉球血渍，浸洗后的溶液倒入另一烧杯内保存。再加入适量50 g·L－1NaOH浸泡棉球，挤压搓洗血渍倒入容器保存。根据棉球血渍洗脱情况，决定是否再浸洗1～2次。将先后所有浸提液混匀，记录所用50 g·L－1NaOH总量，取5 mL浸提液过滤，分别将已过滤的浸提液4 mL、大鼠尾静脉血50 g·L－1NaOH溶液4 mL、以50 g·L－1NaOH为空白对照，在546 nm波长记录吸光度(A)值。

计算公式:子宫出血量(mL)=［尾静脉血量(0.02 mL)×子宫内浸提液A值×V2］/尾静脉血A值×V1。V1=稀释尾静脉血所用50 g·L－1NaOH量(4 mL)，V2=浸提子宫血所用50·L－1NaOH量(mL)。

2.4 模型大鼠血液流变性测定［5］

将100 μL 0.1%的肝素钠加入试管，使其均匀涂过试管内壁，然后80℃烘干备用。动物用5%的水合氯醛麻醉，取颈总动脉血5 mL置于实验前准备的抗凝血试管中，轻轻摇匀，用血液流变分析仪测定全血黏度值(200 s－1，30 s－1，5 s－1，1 s－1)、血浆黏度值(100 s－1)、红细胞聚集指数等血液流变学指标。

2.5 子宫内膜匀浆NO含量测定

Griess试剂配制:配制2%对氨基苯磺酸、0.2%奈乙二胺、5%磷酸，按5∶5∶0.25比例混匀即得Griess试剂。分别取子宫组织200 mg，用冰冷的生理盐水冲洗除去血液，滤纸拭下，用眼科剪剪碎，以冰盐水在冰浴下研磨20%子宫组织匀浆，以3500 r/ min低温离心15 min，取上清液，用Griess法检测NO的含量。Griess试剂和上清液按1∶1混匀后550 nm下检测吸光度，带入标准曲线计算NO含量。

2.6 子宫内膜匀浆TGF-β含量测定

取实验2.5同法制得的子宫匀浆上清液，严格按照ELISA试剂盒说明书检测。

2.7 血浆ET含量检测

颈动脉取血5 mL，置2.4同法制得的肝素钠离心管中，3000 r/min离心15 min取血浆，置－20℃保存。采用放射免疫分析法检测，严格按照试剂盒说明书进行。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 益母草与马齿苋配伍对模型大鼠子宫出血量的影响

表1显示，按照上述方法造模给药并检测子宫出血量。结果显示(空白组大鼠未见出血，故表中未列出)，模型大鼠有一定的出血量(0.442±0.269 mL)，益母草与马齿苋配伍各剂量组可以使模型大鼠子宫出血量显著减少。

表1 益母草与马齿苋配伍对大鼠子宫出血模型出血量的影响(±s)

表1 益母草与马齿苋配伍对大鼠子宫出血模型出血量的影响(±s)

注:与模型组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 剂量(g/kg)动物数(只)子宫出血量(mL) 10 0.442±0.269宫 血 宁 组 0.0702 12 0.099±0.063＊＊益母草与马齿苋配伍 0.5400 12 0.213±0.147*1.0800 12 0.124±0.077＊＊2.1600 12 0.075±0.058模型组＊＊

3.2 药物对模型大鼠血液流变性的影响

造模给药方法同上，实验结束颈总动脉取血，肝素抗凝，用血液流变仪检测模型大鼠血液流变性。表2显示，2.16 g/kg剂量组在200 s－1切变率下有增加全血黏度的作用，其余各剂量组与模型组比较差异无统计学意义，提示益母草与马齿苋配伍有轻微改变模型大鼠血液流变性的作用。

表2 益母草与马齿苋配伍对大鼠子宫出血模型血液流变性的影响(±s)

表2 益母草与马齿苋配伍对大鼠子宫出血模型血液流变性的影响(±s)

注:与模型组比较:*P＜0.05

组别 例数 剂量(g/kg)全血黏度(mPa·s)红细胞聚集指数空 白 对 照 12 — 3.95±0.70 5.26±1.21 10.06±2.41 23.25± 8.53 2 200 s－1 30 s－1 5 s－1 1 s－1血浆黏度(mPa·s)100 s－1.07±0.85 6.00±0.49模 型 组 12 — 3.74±0.6700 5.30±0.90 9.78±1.89 22.51± 4.83 2.57±1.41 6.02±0.99宫 血 宁 组 12 0.0702 3.78±1.11 5.35±1.76 10.13±3.94 24.99±11.16 2.70±1.02 6.15±1.16益母草与马齿苋配伍 12 0.6700 3.81±0.93 5.35±1.55 10.59±2.85 27.74± 7.99 1.68±0.57 6.52±1.29 1.3500 3.48±0.59 4.84±0.73 8.95±1.22 21.77± 3.35 1.86±1.05 5.94±0.57 2.7000 4.25±0.52* 5.57±1.10 10.28±2.35 24.32±11.11 2.68±1.396.31±0.84

3.3 益母草与马齿苋配伍对子宫内膜匀浆NO含量的影响

表3显示，取子宫内膜匀浆测定其NO含量，结果可见，益母草与马齿苋配伍2.16 g/kg剂量组与模型组比较，能明显减少NO含量(P＜0.05)，说明益母草与马齿苋配伍能减少子宫内膜NO产生。

表3 益母草与马齿苋配伍对模型大鼠子宫内膜匀浆NO含量的影响(±s)

表3 益母草与马齿苋配伍对模型大鼠子宫内膜匀浆NO含量的影响(±s)

注:与模型组比较:*P＜0.05 vs

组别 剂量(g/kg)动物数(只) NO含量(umol/L)空 白 对 照 组 —10 34.61±10.87模 型 组 — 12 46.26±27.61宫 血 宁 组 0.0702 12 39.52±28.77益母草与马齿苋配伍 0.5400 12 40.40±12.91 1.0800 12 35.74±5.33 2.1600 12 27.76±9.57*

3.4 益母草与马齿苋配伍对子宫内膜匀浆TGF-β含量的影响

表4显示，药物导致的流产会使TGF-β分泌减少。益母草与马齿苋配伍2.16 g/kg组能升高子宫转化生长因子TGF-β水平，可见益母草与马齿苋配伍可能通过提高TGF-β水平，从而促进修复子宫内膜使其恢复正常生理状态。

表4 益母草与马齿苋配伍对不完全流产大鼠子宫TGF-β含量的影响(±s)

表4 益母草与马齿苋配伍对不完全流产大鼠子宫TGF-β含量的影响(±s)

注:与模型组比较:*P＜0.05

组别 剂量(g/kg)动物数(只) TGF-β (pg/mL)空 白 对 照 组 —10 47.72±22.20模 型 组 — 12 35.49±26.58宫 血 宁 组 0.0702 12 41.54±27.19益母草与马齿苋配伍 0.5400 12 27.29±20.38 1.0800 12 46.48±27.32 2.1600 12 61.91±25.07*

3.5 药物对血浆内皮素(ET)含量的影响

内皮素是子宫血管的强烈收缩剂，促使子宫平滑肌和血管的收缩，能促使血管内膜基底层小动脉收缩而有助于出血的停止。不完全流产大鼠血浆ET含量。表5显示，模型大鼠ET水平比正常大鼠明显升高，提示流产大鼠第7天时已启动自身止血机制。益母草与马齿苋配伍3个剂量组对流产大鼠血浆ET水平未见显著影响。

表5 益母草与马齿苋配伍对不完全流产大鼠血浆ET含量的影响(±s)

表5 益母草与马齿苋配伍对不完全流产大鼠血浆ET含量的影响(±s)

注:与空白组比较:*P＜0.05

组别 剂量(g/kg)动物数(只) ET (pg/mL)空 白 对 照 组 — 10 12.80±3.69模 型 组 — 12 17.04±3.54*宫 血 宁 组 0.0702 12 12.71±4.70益母草与马齿苋配伍 0.5400 12 13.16±6.77 1.0800 12 15.89±5.52 2.1600 12 15.07±5.38

4 讨论

米非司酮配伍米索前列醇建立的早孕大白鼠子宫流产出血模型，可用于功血治疗药的筛选和评价。从实验结果可以看出，益母草与马齿苋配伍能明显缓解米非司酮和米索前列醇导致的早孕大鼠出血症状，显著减少子宫出血量。同时还观察到，益母草与马齿苋配伍可减少子宫NO分泌，提高局部TGF-β水平，这可能是通过增加平滑肌和血管的收缩，促使血管内膜基底层小动脉收缩而有助于出血的停止。益母草与马齿苋配伍对外周血流变和内膜ET影响不大，提示对血液流变性的改变不是其发挥作用的主要机制。

［1］王晓东，赵军宁，张白嘉，等.药物致早孕大鼠子宫出血模型的建立［J］.中国药理学通报，1999，15(2):182-184.

［2］尹艳艳，明亮，李前进，等.妇科止血颗粒对早孕大鼠子宫出血的影响［J］.安徽医科大学学报，2003，38(2):120-122.

［3］王树松，宗文萍，徐铎，等.柿叶对早孕和中晕大鼠药物流产子宫出血的影响［J］.河北中医药学院，2004，19(4):1-3.

［4］赵旭晔，段水竹，张永洛.血立停胶囊干预早孕大鼠药物流产后出血的实验研究［J］.中国药物与临床，2007，7(12):928-930.

［5］闫萍，于风华.柿叶黄酮对药物不全流产大鼠血液流变学影响［J］.河北医药，2007，29(2):124-125.

Influence of compatibility of Herba Leonuri and purslane in incomplete abortion uterine hemorrhage of early pregnant rats

DONG Zi-bo1，LI Chao1△，HONG Min2
(1.Jumpcan Medicines Co.，Ltd.，Jiangsu Taixing 225400，China; 2.Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu Nanjing，210046，China)

Objective:To observe the effects of Motherwort and purslane compatibility in the treatment of bleeding quantity，hemorheology，locally hormonal level and the expression of estrogen and progesterone receptor on incomplete abortion in early-pregnancy rats.Methods:The experiment was carried out in the early-pregnancy model rats with incomplete abortion uterine bleeding induced by mifepristone and misoprostol.To research the effect and mechanism of the drug in the uterine hemorrhage model rats by observation of the effects of bleeding quantity and hemorheology，the content of ET and NO，the hormone level in blood detected by radioimmunoassay and the changes of estrogen and progesterone receptor by immunohistochemistry.Results:Motherwort and purslane compatibility can reduce secretion of NO of uterine，improve local TGF-β level and reduce uterine bleeding.Conclusion:Motherwort and purslane compatibility can obviously relieve the hemorrhagic symptoms in early-pregnancy rats induced by mifepristone and misoprosto1.

Drug abortion;Radioimmunoassay;Immunohistochemistr;Hemorheology

R285.5

B

1006-3250(2015)01-0056-03

2014-10-04

△

李 超(1980-)，男，医学硕士，从事中药新药的研发，Tel:15961037419，E-mail:lc5358583@163.com。